海洋側(cè)孢短芽孢桿菌Lh-1株所產(chǎn)多肽R-1性質(zhì)分析及作用原理探討

任召珍, 孫 謐, 鄭 媛, 劉均忠, 王躍軍, 郝建華, 張勝軍

（1. 山東省海洋食品營養(yǎng)研究院, 山東 榮成 264309; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)院 黃海水產(chǎn)研究所 海洋酶與酶工程實驗室, 山東 青島 266071; 3. 青島市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站, 山東 青島 266071）

海洋側(cè)孢短芽孢桿菌Lh-1株所產(chǎn)多肽R-1性質(zhì)分析及作用原理探討

任召珍1, 孫 謐2, 鄭 媛2, 劉均忠2, 王躍軍2, 郝建華2, 張勝軍3

（1. 山東省海洋食品營養(yǎng)研究院, 山東 榮成 264309; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)院 黃海水產(chǎn)研究所 海洋酶與酶工程實驗室, 山東 青島 266071; 3. 青島市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站, 山東 青島 266071）

對海洋側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus） Lh-1所產(chǎn)多肽R-1的性質(zhì)及作用機(jī)理進(jìn)行了研究。R-1對溫度和pH穩(wěn)定, 在pH 11.0～12條件下, 121 ℃處理1 h, 其活力保持在75%以上。經(jīng)3種不同濃度的蛋白酶（堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶）處理4 h后, 活性保持在80%以上。與常見的金屬離子和化學(xué)試劑在一起反應(yīng), 對抗菌肽 R-1的活性無明顯影響, 可以配合一起使用, 僅吐溫和 SDS對其影響較大。氨基酸分析表明, 抗菌肽R-1由亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、賴氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly）、蛋氨酸（Met）、絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）9種氨基酸組成, 其中疏水氨基酸居多。抑菌試驗表明 R-1的抑菌譜廣泛, 對經(jīng)培養(yǎng)分離出來的大腸桿菌及白假絲酵母菌的掃描電境超微結(jié)構(gòu)觀察表明, R-1的殺菌機(jī)制主要是通過含有帶正電荷的Lys與帶負(fù)電荷的磷脂分子結(jié)合, 然后R-1的疏水端插入到指示菌的疏水區(qū), 改變膜的構(gòu)象, 從而導(dǎo)致菌體的死亡。

海洋側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）; 多肽; 性質(zhì); 作用機(jī)理

海洋覆蓋著地球表面積的 70%, 是生命的發(fā)源地, 其生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過陸地生物的多樣性。在海洋生物中發(fā)現(xiàn)了許多具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的生物活性物質(zhì), 包括抗腫瘤化合物、腫瘤促進(jìn)劑、抗菌、抗病毒化合物、生物毒素等, 目前世界上至少已有 15個以上海洋抗癌物進(jìn)入臨床或臨床前研究階段, 其中相當(dāng)部分生物活性物質(zhì)是陸地生物所沒有的[1,2]。同時海洋微生物活性物質(zhì)可以利用現(xiàn)代微生物發(fā)酵等技術(shù)實現(xiàn)的產(chǎn)業(yè)化, 因此, 海洋微生物生物活性物質(zhì)的研究已成為開發(fā)海洋資源的重要內(nèi)容之一,顯示了廣闊的應(yīng)用前景[3.4]。

本研究從海洋極端環(huán)境中分離到一株具有抗菌活性的側(cè)孢短芽孢桿菌, 其產(chǎn)生的肽類抗菌物質(zhì)R-1對多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和少數(shù)真菌有抑制作用[5]。在此基礎(chǔ)上本工作對R-1的理化性質(zhì)和作用機(jī)理進(jìn)行了初步研究, 為 R-1的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 指示菌

溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticusATCC No.4698）購自Sigma公司。

1.1.2 檢測菌

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、變形鏈球菌（Streptococcus mutans）、白色念珠菌（Candida albicans）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）均由中國生物制品檢定所提供; 糞鏈球菌（Streptococcus Faecium）、肺炎鏈球菌（Streptococcus penamoniae）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）等臨床分離致病菌由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供; 肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridinm botnlinnm）、巴氏固氮梭狀芽孢桿菌（Clostridium pasteurianum）、酪酸梭狀芽孢桿菌（Clostridium butyricum）、腐敗假單胞菌（Pseudomonas putrefaciens）、熱解糖梭狀芽孢桿菌（Clostridiu thermosaccharolyticum）、致黑梭狀芽孢桿菌（Clostridium nigrificans）等食品常見腐敗菌株由黃海水產(chǎn)研究所海洋酶與酶工程實驗室實驗室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基及庖肉培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制。

1.2 主要試劑

R-1由黃海水產(chǎn)研究所海洋酶與酶工程實驗室提供; 胰酶（Difco產(chǎn)品分裝）; 胃蛋白酶（Sigma）; 堿性蛋白酶系本實驗室制備純化。

1.3 測活方法

參照文獻(xiàn)[6]管碟法。在混有適量溶壁微球菌的固體培養(yǎng)基平板上放上不銹鋼制的小管（牛津杯）,在牛津小杯內(nèi)加入抗菌物質(zhì)20 μL, 以抑菌圈直徑表示抑菌活性的大小。

1.4 R-1理化性質(zhì)研究

以下實驗樣品的質(zhì)量濃度均為10 mg/mL。

1.4.1 溫度和pH穩(wěn)定性研究

Glulino Bernal等[7]的研究表明: Bacillus subtilis產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)經(jīng)過100℃/15min和121℃/20min處理后活性無明顯變化。胡劍等[8]報道的一種對蘆筍莖枯病等植物病原菌有抑菌作用的抗菌蛋白, 在高溫酸性環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性, 但是在 pH12、121℃下該抗菌蛋白活性幾乎全部損失了。本實驗在0.05 mol/L、pH 2.6～12.0的廣泛范圍緩沖液, 分別在40、60、80、100、121 ℃下保溫1 h, 測定抑菌活性, 并與25 ℃ pH 6.0時R-1的抑菌活性相比較, 進(jìn)行R-1在不同pH和溫度條件下的穩(wěn)定性研究。

1.4.2 蛋白酶敏感性研究

3種蛋白酶濃度如下: 堿性蛋白酶（15 000 U/mg）,胰蛋白酶（1 500 U/mg）, 胃蛋白酶（1: 3 000）。

用Tris-HCl （pH 8.0）緩沖液配制不同濃度的堿性蛋白酶和胰蛋白酶, 同時用 KCl-HCl（pH 2.0）溶液配制不同濃度的胃蛋白酶, 與R-1 37 ℃水浴反應(yīng)4 h后,之后再80 ℃水浴5 min終止酶活, pH調(diào)回6.5。以不加酶液和緩沖液的樣品為對照, 測定抗菌物質(zhì)活力保持情況。

1.4.3 金屬離子和化學(xué)試劑對R-1活性的影響

在 R-1中加入含各種金屬離子的化學(xué)試劑（0.01 mol/L）和不同濃度的山梨酸鉀、檸檬酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和EDTA, 30 ℃下反應(yīng)4 h, 測定R-1抑菌活性變化。

1.5 氨基酸組成分析

委托中國海洋大學(xué)藥物所李桂玲老師對 R-1的氨基酸組成進(jìn)行分析（835250型氨基酸自動分析儀,日本日立公司）。精密稱量10 mg樣品, 加10 mL 6 mol/L的鹽酸溶液封管, 于110 ℃反應(yīng)22 h冷卻后,開管, 減壓過濾, 濾液定容至10 mL。取1 mL濾液60℃減壓蒸干, 用0.02 mol/L的鹽酸溶液定容到10 mL, 上機(jī)測定。

1.6 抑菌譜的測定

取對數(shù)生長期的各菌株分別涂布平板, 菌體濃度為105個/mL,使用管碟法檢測R-1對指示菌是否有抑菌活性, 活性大小以抑菌圈直徑表示（mm）。

1.7 作用原理研究

按照透射電鏡制備方法[7]制備大腸桿菌和白假絲酵母樣品; 未加 R-1的大腸桿菌和白假絲酵母菌同上制備做空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 R-1的理化性質(zhì)研究

2.1.1 溫度和pH穩(wěn)定性

表1 不同pH、溫度處理下R-1的相對抑菌活力Tab. 1 Effects of pH and temperature on the antimicrobial activity of R-1

R-1經(jīng)如表1所示的pH和溫度條件處理后, 其抑菌活性與25 ℃pH 6.0時R-1的抑菌活性相比較,其結(jié)果由表1可以看出, 在pH 3.0～10.0下, R-1隨著處理溫度的提高, 抑菌能力變化不大, 即使高溫至121 ℃保溫1 h, 抑菌活性仍保持在95%以上; 在pH 2.6下, 隨著溫度的提高, 抑菌能力下降, 但是抑菌活性保持在90%以上; pH 為11～12時, 隨著溫度升高, 抑菌活性下降, 但高溫121 ℃處理1 h, 其活力保持在75%以上, 表明該物質(zhì)對溫度、pH具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.2 蛋白酶對R-1活性的影響

R-1經(jīng)3種不同濃度的蛋白酶作用后, 其相對抑菌活性依然保持在80%以上（圖1）, 可見R-1對蛋白酶不敏感, 不會被蛋白酶降解。

2.1.3 金屬離子對R-1活性的影響

由表 2數(shù)據(jù)可知, R-1 對 Ba2+、Li+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+、Sr2+、Pb2+、Zn2+、Ca2+離子都是穩(wěn)定的,而且這些金屬離子還對抗菌活性有促進(jìn)作用, 說明R-1在有這些金屬離子存在的情況下還能保持很好的抑菌活性, 可以和含有這些金屬離子的化學(xué)試劑配合使用。

2.1.4 化學(xué)試劑對R-1活性的影響

R-1經(jīng)不同濃度的化學(xué)物質(zhì)作用后的結(jié)果表明,山梨酸鉀、檸檬酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和EDTA對R-1活力無影響; 吐溫對R-1的活性有促進(jìn)作用; SDS有抑制作用（圖2）。

2.2 氨基酸組成

經(jīng)分析, R-1含有9種氨基酸。其中疏水氨基酸居多, 而且含有帶正電荷的堿性氨基酸, 這對其跟細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)合提供了條件。R-1的氨基酸組成見表3。

圖1 蛋白酶對R-1活力的影響Fig. 1 Effects of proteases on the antimicrobial activity of R-1

表2 金屬離子對R-1活力的影響Tab. 2 Effects of metal ions on the antimicrobial activity of R-1

圖2 吐溫和SDS對R-1活力的影響Fig. 2 Effects of chemical agents on the antimicrobial activity of R-1

表3 R-1的氨基酸組成Tab. 3 Amino acid composition of R-1

2.3 R-1抑菌譜

由表 4 可知 R-1溶菌譜廣泛, 對多種革蘭氏陽性、陰性菌及部分真菌均有抑菌活性, 尤其是對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌和白假絲酵母菌等致病菌及腐敗假單胞菌、致黑梭狀芽孢桿菌等食品腐敗菌有較強(qiáng)的作用。

2.4 R-1作用原理的初步分析

由圖 3可以看出, R-1對大腸桿菌和白假絲酵母菌的作用機(jī)理不完全相同。R-1對大腸桿菌作用一段時間后, 深色顆粒及胞漿內(nèi)容物成囊狀大量外泄,最終細(xì)胞完全解體; R-1對白假絲酵母菌作用一段時間后, 菌體內(nèi)形成空泡, 胞內(nèi)內(nèi)容物發(fā)生絮凝至菌體死亡。推測是由于細(xì)菌和真菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜不完全相同, 所以R-1的作用方式也不盡相同。

表4 R-1的抑菌譜Tab. 4 Antimicrobial spectrum of R-1

3 討論

通過對 R-1的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn): 該物質(zhì)對溫度和pH穩(wěn)定, 不易被蛋白酶降解, 結(jié)合其氨基酸組成,可以得出 R-1是一種肽類物質(zhì)。關(guān)于抗菌肽的抑菌機(jī)理, 從目前研究成果來看主要是通過作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜, 具體的作用過程是[9～11]: 抗菌肽首先平鋪在細(xì)胞膜上, 通過其所帶的正電荷與脂雙層外側(cè)帶負(fù)電荷的磷脂結(jié)合, 然后取代脂類分子的位置, 使脂雙層外側(cè)發(fā)生扭曲, 細(xì)胞膜產(chǎn)生了相變, 并且出現(xiàn)了短暫的離子通道, 從而導(dǎo)致菌體死亡。

R-1的氨基酸組成主要為疏水氨基酸, 而且含有帶正電荷的Lys, 推測是通過帶正電荷的Lys與帶負(fù)電荷的磷脂分子結(jié)合, 然后 R-1的疏水端插入到指示菌的疏水區(qū), 改變膜的構(gòu)象, 從而導(dǎo)致菌體的死亡。有研究表明, 吐溫可改善原生質(zhì)膜的通透性。吐溫20、吐溫80能增加R-1的活性, 而且隨吐溫濃度的增加抑菌能力增強(qiáng), 這與吐溫能提高膜的通透性有關(guān), 也為R-1作用與細(xì)胞膜提供了證據(jù)[12]。

圖3 透射電鏡下正常大腸桿菌和白假絲酵母與R-1作用后的大腸桿菌和白假絲酵母的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structure of normal E.coli and Candida albicans compared with E.coli and Candida albicans effected by the R-1 under transmission electron microscope

關(guān)于抗菌肽的作用機(jī)制研究還有種學(xué)說[13]: 孔道的形成、開啟和關(guān)閉都依賴于膜的電勢, 只有當(dāng)膜的電勢高于110 mV時, 孔道才能形成或處于開啟狀態(tài)。最近, Lockey等[14]通過電鏡直接觀察到抗菌肽在細(xì)胞膜上造成孔道, 為電勢依賴通道的形成提供了直接證據(jù)。金屬離子 Ba2+、Li+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+、Sr2+、Pb2+、Zn2+、Ca2+對 R-1的抑菌活性有促進(jìn)作用, 推測是其能提高膜的電勢, 從而提高R-1的抑菌活性; 同時SDS對R-1的抑菌活性有抑制作用,因為 SDS是一種陰離子表面活性劑, 減弱了膜的電勢, 從而降低了R-1的抑菌活性。

綜上所述, R-1通過含有帶正電荷的Lys與帶負(fù)電荷的磷脂分子結(jié)合, 然后 R-1的疏水端插入到指示菌的疏水區(qū), 改變膜的構(gòu)象, 從而導(dǎo)致菌體的死亡, 同時能夠提高細(xì)胞膜電勢和提高細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)可以提高R-1的抑菌活性。

[1] Attaway D H, Zaborsky O R. Marine biotechnology.Vol I, Pharmaceutical and bioactive natural products [M]. New York: Plenum Press, 1993.

[2] 許實波．海洋生理活性物質(zhì)的研究及發(fā)展趨勢[J]．生物工程進(jìn)展, 1996, 16（6）: 25-33.

[3] Yotsu M, Yamazaki T, Meguro Y, et al. Production of tetrodotoxm and its derivatives by Pseudomonas sp.Isolated from the skin of the puferfish [J]. Toxicon,1987, 25: 225-228.

[4] Okami Y. Marine micro-organisms as a source of bioactive agents [J]. Microb Ecol, 1986, 2: 65-78.

[5] 任召珍, 鄭媛, 孫謐, 等. 海洋側(cè)孢短芽孢桿菌 Lh-1抗菌活性物質(zhì)的分離及特性研究[J]. 微生物學(xué)報,2007, 47（6）: 997-1 001.

[6] 徐積恩, 朱明珍. 抗生素[M]. 北京: 科學(xué)出版社,1982, 1 521.

[7] Gluliano B, Andres H, Luigi C. Isolation and partial purification of a metabolite from a mutant strain of Bacillus sp. with antibiotic activity against plant pathogenic agents[J]. J Biotenology, 2002, （5）: 1-8.

[8] 胡 劍, 趙永岐, 王岳五．枯草桿菌BS298分泌的抗真菌蛋白的分離純化及其部分性質(zhì)的研究[J]．微生物學(xué)通報, 1997, 24（1）: 3-7.

[9] Mastuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainis and tachyplesins as archetypes [J]. Biochim Biophys Acta, 1999,1 462: l-10.

[10] Yangl Wwiss T M, Lehrer R I, et a1.Crystallizationof antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin [J]. Biophys J, 2000, 79: 2 002- 2 009．

[11] Shaj Y. Mechanism of the binding, insertion and destabi1ization of phospholipid bilayer membranes by alpha-heft-cal antimicrobial and cell non-selective membrane-1ytic peptides [J]. Biochim Biophys Acta,1999, 1 462: 55-70．

[12] Bar-lev S. Kirk T K. Effects of molocular oxygen on ligin degradation by chrysosportum [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1981, 99: 373-378.

[13] 周霞, 諸葛洪祥.抗菌肽的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)·流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊, 2002, 29（5）:310-313.

[14] Timothy D, Lockey, Donald D. Ourth, purification and characterization of lysozyme from hemolymph of Heliothis virescens Larvae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996, 220（3）: 502-508.

Received: Sep, 20, 2009

Key words:Brevibacillus laterosporus, peptide, Properties, Bacteriostatic mechanism

Abstract:We reported the properties and bacteriostatic mechanism of the antimicrobial peptide R-1from marine Brevibacillus laterosporus. R-1 was very stable to keep the antibacterial activity even after incubation at 121 ℃ and in the pH rang of 11.0～12.0 for 1 hours. In addition, R-1 was insensitive to trypsin, chymotrypsin, and alkaline proteinase. R-1 activity was slightly enhanced by Ba2+, Li+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, Sr2+, Pb2+, Zn2+,and Ca2+. R-1 showed good compatibility to many common chemical reagents, including EDTA and KH2PO4. Tween and SDS showed obvious effects. Amino acid analysis of R-1 showed that R-1 was composed of Leu, Tyr, Val, Ile, Lys, Gly, Met, Ser, and Ala. R-1 had broad-spectrum against many bacteria including a number of pathogens. Observation by scanning electron microscopy suggested that the bioactivity mechanism of R-1 lied in pertoration of cell membrane, leading to bacterium lysis and death.

（本文編輯:康亦兼）

Properties and bacteriostatic mechanism of the antimicrobial peptide R-1

REN Zhao-zhen1, SUN Mi2, ZHENG Yuan2, LIU Jun-zhong2, WANG Yue-jun2, HAO Jian-hua2, ZHANG Sheng-Jun3
（1. Shangdong Marine Food Nutrition Research Institute,Rongcheng 264309, China; 2. Laboratory of Marine Enzyme and Enzyme Engineering, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Qingdao 266071, China; 3.Qingdao Environmental Monitoring Station, Qingdao 266071, China）

Q936

A

1000-3096（2010）11-0041-05

2009-09-20;

2009-12-23

國家自然科學(xué)基金項目（30571429）; 國家“863”計劃項目（2006AA10Z349）; 青島市科技計劃項目（05-2-JC-81）

任召珍（1981-）, 女, 山東省萊州市, 碩士研究生, 主要從

事海洋微生物活性產(chǎn)物的分離純化和性質(zhì)研究, 電話: 13792780867,E-mail: zzren1012@126.com; 孫謐, 通信作者, 電話: 0532-85819525,Email: sunmi@ysfri.ac.cn