兩種體色三疣梭子蟹線粒體DNA部分片段序列的比較分析

遲大利, 高 煥 沈頌東, 閻斌倫

（1. 淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005; 2. 蘇州大學(xué)生命科學(xué)院, 江蘇蘇州 215123）

兩種體色三疣梭子蟹線粒體DNA部分片段序列的比較分析

遲大利1,2, 高 煥1, 沈頌東2, 閻斌倫1

（1. 淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005; 2. 蘇州大學(xué)生命科學(xué)院, 江蘇蘇州 215123）

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）作為重要的海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物, 其常見體色（頭胸甲）為茶綠色。近年來在我國(guó)沿海海域海捕三疣梭子蟹中開始出現(xiàn)體色為紫色的一類梭子蟹, 除體色不同外, 二者表型特征并無顯著差異。對(duì)兩種體色三疣梭子蟹不同個(gè)體的線粒體COI和16S rRNA基因進(jìn)行了序列比對(duì)分析以判定二者之間的親緣關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)COI和16S rRNA基因在兩種體色三疣梭子蟹群體中的核苷酸序列一致性分別為99.87%和99.88%, 表明紫色三疣梭子蟹并未發(fā)生亞種的分化, 即紫色和茶綠色群體屬于同一個(gè)種。并利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了梭子蟹科其他15種海產(chǎn)蟹的16S rRNA序列, 進(jìn)行了序列同源性比對(duì)分析和分子系統(tǒng)學(xué)方面的探討, 為梭子蟹種屬分類學(xué)研究提供分子依據(jù)。

三疣梭子蟹; 體色; 線粒體DNA; 16S rRNA; COI

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）隸屬于甲殼綱（Crustacea）, 十足目（Decapoda）, 梭子蟹科（Portunidae）, 梭子蟹屬（Portunus）, 又稱梭子蟹、槍蟹、海螃蟹、海蟹、門蟹等, 是一種大型海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物, 廣泛分布于中國(guó)、日本、朝鮮等西太平洋沿岸海域[1], 具有肉質(zhì)好、食物鏈短、生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[2], 是我國(guó)重要的海洋漁業(yè)資源。鑒于其較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及其在生態(tài)環(huán)境中的重要作用, 自20世紀(jì)50年代起, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼對(duì)三疣梭子蟹生活習(xí)性、生理生化、胚胎發(fā)育、養(yǎng)殖模式、群體遺傳結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)觀察和核型分析等方面做了深入的研究, 而對(duì)三疣梭子蟹分子生物學(xué)展開的研究工作尚處于起步階段, 且主要集中在分子標(biāo)記研究領(lǐng)域[3]。

常見三疣梭子蟹體色（頭胸甲）為茶綠色, 近年來, 在我國(guó)從渤海到東海廣大海域的海捕野生群體中發(fā)現(xiàn)一類體色為紫色的梭子蟹。從形態(tài)上觀察, 除了身體顏色存在差異外, 兩種體色梭子蟹其他表型特征相似。對(duì)于此類紫色梭子蟹的來源有不同的說法: 有的認(rèn)為雌性梭子蟹為紫色, 雄性蟹為茶綠色[4];有的認(rèn)為它們屬于兩個(gè)不同的種[5]。因此, 有必要了解不同體色梭子蟹之間的關(guān)系及其與其他蟹類的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系。

由于母性遺傳、進(jìn)化率低以及缺乏分子間遺傳重組等特點(diǎn), 線粒體DNA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和不同分類水平物種間親緣關(guān)系的研究[6]。迄今為止, 線粒體兩個(gè)保守序列基因COI（細(xì)胞色素c氧化酶亞基I基因）和16S rRNA基因已經(jīng)成功應(yīng)用于甲殼類動(dòng)物的生物學(xué)親緣關(guān)系鑒定[7]。通過應(yīng)用長(zhǎng)PCR技術(shù), Yamauchi等[7]首次對(duì)三疣梭子蟹線粒體基因組進(jìn)行全序列分析研究。郭天慧等[2]對(duì)三疣梭子蟹線粒體DNA COI和16S rRNA基因片段序列進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn), 16S rRNA基因較 COI基因更為保守,表明 COI基因適于種內(nèi)遺傳多態(tài)性研究, 而 16S rRNA基因適于種屬間遺傳多態(tài)性分析。

Place等[8]對(duì)可口美青蟹（Callinectes sapidus）整個(gè)線粒體基因組進(jìn)行了測(cè)序和基因定位, 發(fā)現(xiàn)可口美青蟹和三疣梭子蟹線粒體基因組長(zhǎng)度（分別為16 263 bp 和16 026 bp）十分接近, 且二者線粒體基因組內(nèi)基因序列及相關(guān)功能基因的定位均十分相似,表明三疣梭子蟹和可口美青蟹的親緣關(guān)系相近, 但是, 三疣梭子蟹和可口美青蟹分別生活在太平洋和大西洋沿岸[8], 處于地理隔離狀態(tài), 分類學(xué)上分別隸屬于梭子蟹屬和青蟹屬（Callinectes）, 且二者體色亦有不同, 因此有必要了解二者在分子系統(tǒng)分類學(xué)中的關(guān)系。

本文期望通過線粒體DNA COI和16S rRNA部分基因片段在茶綠色和紫色梭子蟹間的序列比對(duì)分析, 以闡釋清楚兩種體色梭子蟹的親緣關(guān)系, 即二者是否達(dá)到亞種的分化水平; 并對(duì)三疣梭子蟹與梭子蟹屬其他 14種梭子蟹以及青蟹屬可口美青蟹的16S rRNA基因進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析, 以探討三疣梭子蟹與其他海產(chǎn)蟹類的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用紫色和茶綠色三疣梭子蟹購(gòu)自連云港水產(chǎn)品市場(chǎng), 時(shí)間為2007年10月至2008年3月。

1.2 樣品DNA的提取

取三疣梭子蟹附肢肌肉, 使用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的樹脂型TM基因組 DNA提取試劑盒提取基因組DNA, 經(jīng)Gene QuantPro核酸定量?jī)x（通用公司, 美國(guó)）測(cè)定基因組DNA濃度, -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及目的基因序列測(cè)定分析

三疣梭子蟹線粒體DNA COI和16S rRNA基因片段擴(kuò)增所用特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列參見郭天慧等[2]的文獻(xiàn),分別為 COI-H/COI-L（正向: 5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’, 反 向 : 5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’）和16S-AR/16S-BR（正向: 5’-cgcctgtttatcaaaaacat-3’, 反向: 5’-ccggtctgaactcagatcacgt-3’）。

PCR 反應(yīng)體系（25.0 μL）為: ddH2O 12.3 μL, 10×PCR 緩沖液 2.5 μL, 25 mmol/L MgCl22.0 μL, 10 μmol/L dNTPs 2.0 μL, 5 U/μLTaqDNA 聚合酶 0.2 μL,10 μmol/L 上下游引物各 2.0 μL, 500 μg/L DNA 模板2.0 μL。PCR擴(kuò)增條件為: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性45 s, 48 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 循環(huán)30次; 最后72 ℃延伸5 min。PCR試劑均購(gòu)自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司。

PCR擴(kuò)增所得目的DNA片段直接送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定, 再通過DNAMAN（Version 6.0.40）軟件進(jìn)行紫色和茶綠色梭子蟹線粒體DNA COI和16S rRNA基因片段序列比對(duì)分析。

1.4 16種海產(chǎn)蟹16S rRNA基因片段的序列分析及分子系統(tǒng)學(xué)探討

根據(jù)三疣梭子蟹的種屬特異性及序列分析結(jié)果,在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中有選擇性地檢索出同屬于梭子蟹科（Portunidae）的、梭子蟹屬其他 14種梭子蟹（P.anceps;P. bahamensis;P. binoculus;P. depressifrons;P.floridanus;P. gibbesii;P. ordwayi;P. rufiremus;P. sayi;P. sebae;P. spinicarpus;P. spinimanus;P. ventralis;P.vossi）及青蟹屬可口美青蟹（C. sapidus）的 16S rRNA基因片段, 共15種海產(chǎn)蟹類型。利用DNAMAN軟件對(duì)三疣梭子蟹與這15種海產(chǎn)蟹的線粒體DNA 16S rRNA基因片段核苷酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析, 并以可口美青蟹作為外類群進(jìn)行分子系統(tǒng)分析。鄰接法（Neighbor-joining, NJ）分析使用Kimura 2-paramater,系統(tǒng)樹分支的置信度采用重復(fù)抽樣分析（Booststrap analysis）的方法, 重復(fù)抽樣的次數(shù)為1000次。

2 結(jié)果

2.1 線粒體DNA COI和16S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用三疣梭子蟹基因組DNA為模板對(duì)其線粒體 COI和 16S rRNA基因部分片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。結(jié)果表明, 兩個(gè)基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均產(chǎn)生了清晰可辨的擴(kuò)增條帶, 且二者擴(kuò)增條帶分子量大小與參考文獻(xiàn)[2]相一致。

2.2 線粒體DNA COI和16S rRNA基因的序列分析

從COI和16S rRNA基因PCR擴(kuò)增樣品中分別隨機(jī)選取4個(gè)紫色和4個(gè)茶綠色個(gè)體的擴(kuò)增樣品進(jìn)行測(cè)序分析（圖1和圖2）。經(jīng)測(cè)定分析后得到了長(zhǎng)度為658 bp的COI基因序列和長(zhǎng)度為524 bp的16S rRNA基因序列。相關(guān)序列分析結(jié)果為: 紫色和茶綠色梭子蟹個(gè)體中COI基因（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)（DNA堿基比）分別為46.8%和46.7%; 兩類個(gè)體中16S rRNA基因（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)均為53.15%; 經(jīng)DNAMAN軟件分析合并的COI和16S rRNA基因中（A+T）含量分別為63%（A=36.6%; C=16.4%; G=20.5%; T=26.4%）和69.7%（A=34.5%; C=12.4%; G=18.0%; T=35.2%）, 這與三疣梭子蟹整個(gè)線粒體DNA序列中70.2%的（A+T）含量相近[7], 而且, COI和16S rRNA基因在紫色和茶綠色群體間的核苷酸序列一致性（sequence identity）分別達(dá)到了99.87%和99.88%。

2.3 三疣梭子蟹 16S rRNA基因與其他海產(chǎn)蟹的同源性比較

經(jīng) GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)選擇性地檢索, 得到用于同源性比對(duì)分析的梭子蟹科共15種海產(chǎn)蟹16S rRNA基因片段, 相應(yīng)分類和GenBank登錄號(hào)見表1。

圖1 紫色（P）和茶綠色（G）梭子蟹個(gè)體COI基因片段的序列比對(duì)Fig. 1 Multiple sequence alignment of COI gene fragments of tea-green （G） and purple （P） crab samples

由于選取的 16種海產(chǎn)蟹屬于同一科（梭子蟹科）內(nèi)不同屬間的類型, 其中 15種為同一屬（梭子蟹屬）內(nèi)不同種間的類別, 本文通過常用于系統(tǒng)發(fā)生比較的線粒體DNA 16S rRNA基因?qū)?6種海產(chǎn)蟹的核苷酸序列同源性進(jìn)行分析比較。DNAMAN軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析所得結(jié)果見表2。

圖2 紫色（P）和茶綠色（G）梭子蟹個(gè)體16S rRNA基因片段的序列比對(duì)Fig. 2 Multiple sequence alignment of 16S rRNA gene fragments of tea-green （G） and purple （P） crab samples

表1 用于16S rRNA基因比對(duì)分析的梭子蟹科15種海產(chǎn)蟹的分類學(xué)位置及GenBank登錄號(hào)Tab. 1 Classification of 15 species of Portunidae and the GenBank accession numbers for 16S rRNA analysis

16種海產(chǎn)蟹之間的16S rRNA基因核苷酸序列一致性（sequence identity）為 88.06%, 序列同源性（sequence homology）范圍為 76.2%～100%。梭子蟹P.anceps和P. rufiremus之間的16S rRNA基因核苷酸序列同源性最低, 為 76.2%; 梭子蟹P. bahamensis和P.depressifrons以及P. spinimanus和P. vossi之間的16S rRNA基因核苷酸序列同源性最高, 均達(dá)到100%。與其他15種海產(chǎn)蟹16S rRNA基因同源性比對(duì)分析結(jié)果表明, 三疣梭子蟹和其他不同種屬海產(chǎn)蟹間的核苷酸序列的同源性為81.7%～91.7%, 其中, 與賽氏梭子蟹（P.sayi）同源性最高, 達(dá)到91.7%; 與P. rufiremus的同源性最低, 為81.7%; 而與可口美青蟹（C. sapidus）的同源性僅次于賽氏梭子蟹, 達(dá)到87.7%。

表2 16種海產(chǎn)蟹線粒體DNA 16S rRNA基因核苷酸部分序列同源性比較Tab. 2 Comparison of sequence homology （%） among 16S rRNA genes from 16 species of Portunidae

2.4 16S rRNA基因在系統(tǒng)學(xué)分析中的應(yīng)用

基于線粒體 DNA 16S rRNA基因核苷酸序列,以可口美青蟹為外群對(duì)16種海產(chǎn)蟹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過應(yīng)用鄰接法（NJ法）構(gòu)建的的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹（圖 3）, 枝長(zhǎng)表示分歧度, 枝上的數(shù)值是 1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的置信度值。聚類分析結(jié)果表明, 三疣梭子蟹首先與賽氏梭子蟹（P. sayi）聚為一類, 再與可口美青蟹聚在一起。另外, 梭子蟹P. bahamensis和P. depressifrons以及P. spinimanus和P. vossi之間的 16S rRNA基因核苷酸序列的高同源性在分子系統(tǒng)樹的聚類結(jié)果中也反映了這一點(diǎn)。由于針對(duì)梭子蟹種屬內(nèi)的研究主要集中在三疣梭子蟹等重要經(jīng)濟(jì)種類, 且天然地理分布阻隔也造成對(duì)梭子蟹屬內(nèi)各種之間的分類學(xué)研究較為匱乏, 該聚類分析結(jié)果可為梭子蟹種屬分類學(xué)研究提供分子依據(jù)。

圖3 基于16種海產(chǎn)蟹線粒體DNA 16S rRNA基因核苷酸序列通過鄰接法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹（NJ樹）Fig. 3 Molecular phylogenetic tree on the nucleotide sequence of 16S rRNA gene from 16 species of Portuni dae constructed by Neighbour-Joining method （NJ tree）

3 討論

3.1 線粒體保守序列基因分析在系統(tǒng)分類學(xué)中的應(yīng)用探討

當(dāng)前, 動(dòng)物分子分類學(xué)研究成果多建立在線粒體DNA相關(guān)基因序列分析的基礎(chǔ)之上。線粒體中核糖體 RNA基因（rRNAs）和細(xì)胞色素 c氧化酶亞基 I基因（COI）的核苷酸序列比對(duì), 是分子系統(tǒng)親緣分析行之有效的方法[9]。陳麗梅等[10]對(duì) 3種蟶類 16S rRNA和 COI基因片段序列進(jìn)行了比較并對(duì)其系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行了初步研究, 發(fā)現(xiàn)COI基因的進(jìn)化速率與16S rRNA基因相比要快, 16S rRNA基因則相對(duì)保守一些。徐琰等[11]通過運(yùn)用16S rRNA基因序列初步探討了部分真蝦類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 結(jié)果表明, 16S rRNA基因片段的序列很適合研究真蝦類屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 而在研究屬以上高級(jí)階元或種以下階元間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系時(shí)較不敏感, 因其變異對(duì)于種級(jí)水平顯得過于保守, 而對(duì)于科級(jí)以上階元又顯得過快。蔣欽楊等[12]在 3個(gè)不同群體羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）線粒體16S rRNA基因序列分析及遺傳差異比較中也指出, 線粒體16S rRNA基因是動(dòng)物種內(nèi)個(gè)體間較為保守的序列, 主要用于種以上水平的變異分析。在細(xì)菌分類學(xué)鑒定方面,16S rRNA基因序列分析是當(dāng)前細(xì)菌分類中最精確的一種技術(shù)[13]。劉佳文等[14]指出通過分子生物學(xué)技術(shù)分析16S rRNA基因, 可將分枝桿菌（Mycobacterium）鑒定到種的水平。由于具有較強(qiáng)的中間解析和鑒別能力, 線粒體16S rRNA基因正廣泛應(yīng)用于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)與進(jìn)化學(xué)及種類鑒別中[15]。

目的基因序列測(cè)定及比對(duì)分析可以直觀反映兩個(gè)群體之間的親緣關(guān)系。以細(xì)菌鑒定為例, 當(dāng)兩DNA間同源性為 100%, 即可認(rèn)為是源于同一個(gè)體;同源性為80%～90%則被認(rèn)源于為同一種內(nèi)或同一亞種; 同源性為 60%～70%被認(rèn)為源于同一種內(nèi)的不同亞種, 同源性為 20%～60%則被認(rèn)為是源于同一屬的不同種（http://space.biox.cn/3776/viewspace-4586.html）。對(duì)不同個(gè)體或群體間DNA堿基比（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)的差異比較的分析方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的分類學(xué)的親緣關(guān)系鑒定的研究中。一般認(rèn)為, （G+C） 摩爾分?jǐn)?shù)相差超過5%就不可能屬于同一個(gè)種, 相差超過10%就可考慮是不同屬[16]。本實(shí)驗(yàn)選取的線粒體DNA兩個(gè)保守基因的序列比對(duì)分析結(jié)果顯示了COI和16S rRNA在兩個(gè)群體中均接近100%的核苷酸序列一致性, 且紫色和茶綠色梭子蟹群體中 COI基因（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)差別為 0.1%; 16S rRNA基因（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)則完全相同, 說明紫色和茶綠色梭子蟹群體間親緣關(guān)系十分相近, 二者同屬于一個(gè)種, 紫色三疣梭子蟹并未發(fā)生亞種分化。

在 COI基因序列比對(duì)分析中, 紫色梭子蟹個(gè)體間僅發(fā)現(xiàn)單堿基差異, 序列歧異為轉(zhuǎn)換（G-A）; 而茶綠色梭子蟹不同個(gè)體間有較多的（6個(gè)）堿基突變, 序列歧異基本上是轉(zhuǎn)換（T-C, G-A）多于顛換（G-C）, 且其中有一處單堿基序列差異（G-A）與紫色梭子蟹個(gè)體相同, 這說明紫色梭子蟹群體的線粒體DNA序列在進(jìn)化關(guān)系上較為保守（圖1）; 在16S rRNA基因序列比對(duì)分析中, 紫色和茶綠色梭子蟹群體內(nèi)不同個(gè)體間均只出現(xiàn)單堿基突變, 而且僅為單堿基 T的重復(fù)序列數(shù)目不同（圖2）, 反映了16S rRNA基因高度保守的特性, 說明16S rRNA基因更適用于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)物種之間的分類學(xué)研究鑒定。

在利用線粒體DNA 16S rRNA基因?qū)?6種海產(chǎn)蟹的核苷酸序列同源性進(jìn)行分析中, 三疣梭子蟹與可口美青蟹的同源性僅次于賽氏梭子蟹（91.7%）, 達(dá)到87.7%, 且DNAMAN軟件分析表明三疣梭子蟹與可口美青蟹間的 16S rRNA基因核苷酸序列一致性達(dá)到 83.00%, 表明二者相近的親緣關(guān)系。以上結(jié)果表明, 海產(chǎn)蟹線粒體DNA 16S rRNA基因是相對(duì)保守的, 適合用于梭子蟹科內(nèi)不同種間同源性比較及遺傳多樣性的分析。

鑒于本實(shí)驗(yàn)所用線粒體DNA COI和16S rRNA基因序列均未檢測(cè)到可用于鑒定兩種體色三疣梭子蟹間的差異, 可進(jìn)一步對(duì)線粒體DNA中核苷酸序列變化較大的區(qū)域（如, 線粒體 DNA 控制區(qū)[17,18]等）進(jìn)行序列比較分析, 以得到基于堿基序列差異的不同體色三疣梭子蟹間的具體親緣關(guān)系。

3.2 三疣梭子蟹體色成因分析

體色在海洋蟹類的生活史中扮演重要的角色。首先它可以作為一種保護(hù)色, 與周圍生活環(huán)境融為一體, 有利于規(guī)避天敵和捕食獵物; 其次, 體色可以作為一種交流信號(hào), 與其特定的生活生理特征相聯(lián)系; 再次, 體色的改變可能與其生活環(huán)境的變化有關(guān), 如招潮蟹（Uca pugilator）便具有因環(huán)境溫度高低和光強(qiáng)的強(qiáng)弱而改變身體顏色的特性[19]。

自然界中, 同一物種內(nèi)具有不同體色個(gè)體或群體的現(xiàn)象十分普遍, 針對(duì)體色遺傳變異等方面的研究也比較深入。鄭懷平等[20]根據(jù)貝殼顏色的差異對(duì)海灣扇貝（Argopecten irradians）家系的建立及其成長(zhǎng)發(fā)育過程進(jìn)行了觀察研究, 發(fā)現(xiàn)體色（殼色）作為一個(gè)可遺傳的質(zhì)量性狀, 它與表型性狀的聯(lián)系可能與貝類的遺傳、生理特性以及生態(tài)環(huán)境等有關(guān)。在本研究所觀察到的三疣梭子蟹既然同屬于一個(gè)種, 那么其體色的變化很可能是由環(huán)境因素或者遺傳因素引起的。同時(shí)在實(shí)際觀察中了解到, 雌蟹和雄蟹中都有紫色和茶綠色個(gè)體的存在, 因此否定了雌蟹為紫色, 雄蟹為茶綠色的說法[4]。另外, 在養(yǎng)殖中雖然有個(gè)別紫色個(gè)體體色會(huì)褪色為接近茶綠色個(gè)體體色的現(xiàn)象, 但其與茶綠色體色仍存在著明顯的差異, 且同等條件下絕大多數(shù)紫色個(gè)體顏色不會(huì)發(fā)生明顯變化。因此, 基于以上分析, 可以認(rèn)為三疣梭子蟹產(chǎn)生紫色和茶綠色兩種明顯體色差異的原因是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果, 產(chǎn)生體色差異的具體原因有待進(jìn)一步地深入研究。

[1] Hamasaki K, Fukunaga K, Kitada S. Batch fecundity of the swimming crab Portunus trituberculatus （Brachyura: Portunidae）[J]. Aquaculture, 2006, 253: 59-365.

[2] 郭天慧, 孔曉瑜, 陳四清, 等. 三疣梭子蟹線粒體DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的比較研究[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 34（1）: 22-28.

[3] 遲大利, 閻斌倫, 高煥, 等. 三疣梭子蟹分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2008, 29（4）:11-15.

[4] 蘇秀榕, 李太武, 歐陽芬, 等. 三疣梭子蟹營(yíng)養(yǎng)成分的研究[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 1996, 18（3）: 342-346.

[5] 孫先交. 三疣梭子蟹越冬、育苗及養(yǎng)殖[J]. 齊魯漁業(yè),2001, 18（4）: 18-20.

[6] Avise J C. Phylogeography[M]. London: Harvard Univesity Press, 2000. 447.

[7] Yamauchi M M, Miya M U, Nishida M. Complete mitochondrial DNA sequence of the swimming crab,Portunus trituberculatus （Crustacea: Decapoda:Brachyura）[J]. Gene, 2003, 311: 129-135.

[8] Place A R, Feng X J, Steven C R, et al. Genetic markers in blue crabs （Callinectes sapidus） II: Complete mitochondrial genome sequence and characterization of genetic variation[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2005, 319: 15-27.

[9] Bandyopadhyay P K, Stevenson B J, Cady M T, et al.Complete mitochondrial DNA sequence of a Conoidean gastropod, Lophiotoma （Xenuroturris） cerithiformis:Gene order and gastropod phylogeny[J]. Toxicon, 2006,48: 29-43.

[10] 陳麗梅, 孔曉瑜, 喻子牛, 等. 3種蟶類線粒體 16S rRNA和COI基因片段的序列比較及其系統(tǒng)學(xué)初步研究[J]. 海洋科學(xué), 2005, 29（8）: 27-32.

[11] 徐琰, 宋林生, 李新正. 用 16S rDNA序列初步探討部分真蝦類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J]. 海洋科學(xué), 2005,29（9）: 36-41.

[12] 蔣欽楊, 楊學(xué)明, 郭亞芬, 等. 3個(gè)不同群體羅氏沼蝦線粒體16S rRNA基因序列分析及遺傳差異[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2005, 24（10）: 28-31.

[13] 郭亞輝, 郭堅(jiān)華, 李斌. 根據(jù) 16S rRNA序列對(duì)假單胞菌屬分類學(xué)的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志, 2004,24（2）: 38-41.

[14] 劉佳文, 呂紅艷, 吳雪瓊, 等. 16S rRNA基因序列在分枝桿菌分類鑒定的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè), 2001, 22（5）: 265-268.

[15] 孔曉瑜, 姜艷艷, 相建海, 等. 魁蚶線粒體16S rRNA和 COI基因片段序列測(cè)定及其應(yīng)用前景[J]. 海洋科學(xué), 2001, 25（12）: 46-48.

[16] 張文治. 微生物學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2005:p240.

[17] 朱世華, 鄭文娟, 鄒記興, 等. 科魚類線粒體DNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J]. 動(dòng)物學(xué)研究, 2007,28（6）: 606-614.

[18] 郭學(xué)光, 郭喬楠. 線粒體 DNA 控制區(qū)研究進(jìn)展[J].腫瘤防治雜志, 2005, 12（22）: 1747-1750.

[19] Silbiger N, Munguia P. Carapace color change in Uca pugilator as a response to temperature[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2008,335: 41-46.

[20] 鄭懷平, 張國(guó)范, 劉曉, 等. 不同貝殼顏色海灣扇貝（Argopecten irradians）家系的建立及生長(zhǎng)發(fā)育研究[J].海洋與湖沼, 2003, 34（6）: 632-639.

Received: Sep., 10, 2009

Key words:Portunus trituberculatus; boby-color, mitochondrial DNA; 16S rRNA; COI

Abstract:The blue swimming crabs, an important commercial species, with different body-colors were discovered along the coast of East China in recent years. Both purple and tea-green crabs have similar, even the same physical characteristics except for the carapace color. In order to identify the relationships between them,we amplified and compared two conserved mitochondrial gene fragments of color-different crabs through DNA sequencing analyses. The sequence alignment analysis of color-different crabs presented 99.87% and 99.88% nucleotide sequence identity for the COI and 16S rRNA genes, respectively, indicating that there was no species or subspecies differentiation between them. Based on the alignment of nucleotide sequences, a phylogenetic tree of 16S rRNA genes from 16 species of Portunidae was constructed. It may serve as a basis for the taxonomy of portunid crabs.

（本文編輯:張培新）

Comparison analysis between purple and tea-green individuals of Portunus trituberculatus using mitochondrial partial genes

CHI Da-li1,2, GAO Huan1, SHEN Song-dong2, YAN Bin-lun1
（1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005,China; 2. Life Sciences College, Suzhou University, Suzhou 215123, China）

Q178.532

A

1000-3096（2010）11-0027-08

2009-09-10;

2009-11-12

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目（2006BAD09A01）作者簡(jiǎn)介: 遲大利（1983-）, 男, 山東龍口人, 碩士研究生, 從事三疣梭子蟹體色相關(guān)分子標(biāo)記研究, E-mail: charliedl@163.com; 通信作者: 閻斌倫, 教授, 從事蝦蟹類養(yǎng)殖工作, 電話: 0518-85895252, E-mail:

yanbinlun@yahoo.com.cn