-80℃冰凍保存對血小板聚集功能的影響

何麗娟，鄧為彬，李永萍

（1.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理 671000；2.嘉興市第二醫(yī)院，浙江嘉興 314000）

-80℃冰凍保存對血小板聚集功能的影響

何麗娟1，鄧為彬2，李永萍1

（1.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理 671000；2.嘉興市第二醫(yī)院，浙江嘉興 314000）

目的：初步了解-80℃冰凍保存對血小板聚集功能的影響。方法：采集健康人新鮮血進(jìn)行離心，制作富含血小板的血漿（PRP），用血小板聚集儀檢測聚集功能；將分離的血小板分別加入保護(hù)劑5%二甲基亞砜（5%DMSO）后迅速置于-80℃低溫冰箱保存1月，復(fù)蘇后再次對血小板聚集功能進(jìn)行檢測。結(jié)果：血小板聚集率和聚集率單位時(shí)間的變化冰凍前后對比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：血小板加終濃度為5%DMSO，在-80℃條件下冰凍保存1個(gè)月，血小板的聚集功能穩(wěn)定。

血小板；冰凍保存；聚集功能

聚集功能是評價(jià)血小板體外功能的重要指標(biāo)，也是血小板的一個(gè)重要生理特性，同時(shí)是其參與止血和血栓形成過程的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)嘗試國際普遍使用的生物冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜（DMSO）對人工分離濃縮血小板進(jìn)行深低溫（-80℃）保存，并對解凍后的血小板進(jìn)行聚集功能檢測，以期為臨床用血提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 采集12名健康志愿者的血液，獻(xiàn)血者均是某大學(xué)在校大學(xué)生，年齡21～26歲，男女各6人，其中2名為外國留學(xué)生，符合我國獻(xiàn)血體檢標(biāo)準(zhǔn)。在獻(xiàn)血前1 d內(nèi)未飲用過含酒精類飲料，2周內(nèi)未服用過阿司匹林及其他抗血小板及抗凝血的任何相關(guān)藥物，未檢測到出、凝血性疾病。血細(xì)胞比容≥0.36，外周血Plt＞150×109/L。將所采集的10 m L/人（份）全血共12份，抗凝劑枸櫞酸鈉（ACD）與全血比為1∶9，置于室溫（20℃左右）進(jìn)行樣本處理。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 ①二磷酸腺苷（ADP）試劑（購于美國Helenna公司）；②DMSO（天津化學(xué)試劑有限公司；③-80℃冰箱（Forma，美國）；④APACT4血小板聚集儀（德國）。

1.3 方法

1.3.1 靜脈取血 健康志愿者空腹抽取靜脈血置于抗凝液的離心管中1∶10體積（1mL枸櫞酸鈉+9mL靜脈血），抽血完后輕輕震蕩搖勻，室溫為20~24℃。

1.3.2 富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）的制備 將上述的采血離心管在天平上調(diào)至平衡（每次離心均需要配平）兩側(cè)對稱放入離心機(jī)中，經(jīng)500r/min離心11 min，輕輕取上層黃色清亮液體即制備出新鮮富含血小板血漿（FPRP）。

1.3.3 貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）的制備 取上層液PRP剩下血漿高速離心（4 000 r/min離心20min），輕輕取上層黃色清亮液體即制備出新鮮貧血小板血漿（FPPP）。

1.3.4 血小板的保存 留取一半新鮮的PRP和PPP進(jìn)行血小板相關(guān)測定，剩下的一半在潔凈的環(huán)境中采用嚴(yán)格的無菌技術(shù)緩慢加入生物冷凍保護(hù)劑DMSO到冰凍管里至終濃度為（5.0±0.5）%，然后用濕棉布包冰凍管置-80℃冰箱保存，每冰凍管產(chǎn)品留樣量4～5mL凍存，冰凍管予擰緊管蓋密封保存。1個(gè)月后，取出冰凍制品在恒溫水浴箱里（溫度37～40℃）快速解凍，輕輕搖動至融化。

1.3.5 血小板聚集功能的測定 以ADP為誘導(dǎo)劑采用比濁法測定（嚴(yán)格按照APACT4血小板聚集儀操作說明）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組資料統(tǒng)計(jì)分析采用配對資料t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有資料均使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

新鮮血小板和-80℃冰凍保存1個(gè)月血小板最大聚集率（Aggregation）和聚集斜度時(shí)間變化率（Slope）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1及圖1、2、3。

表1 -80℃冰凍保存前后血小板聚集功能的變化/%

圖1 血小板冰凍前后A ggregation的對比

圖2 血小板冰凍前后S lope的對比

圖3 冰凍前后血小板聚集率的比較

B.冰凍后聚集率

3 討論

聚集作用是血小板的重要生物功能之一，長期以來血小板聚集活性的檢測一直是血小板體外功能評價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)。目前認(rèn)為，血小板活化聚集主要通過3條途徑：花生四烯酸（AA）途徑、ADP途徑和血小板活化因子（PAF）途徑〔1〕。AA、ADP、PAF通過不同的機(jī)制誘導(dǎo)血小板聚集。20世紀(jì)60年代，Born〔2〕首先采用了比濁法測定血小板聚集率。比濁法檢測血小板聚集是近幾十年來在臨床和研究中最常用的方法，利用血小板聚集儀能夠比較方便、快速地獲得血小板聚集情況來評價(jià)血小板的聚集功能。其不足之處是離心等步驟容易導(dǎo)致血小板體外激活。

血小板在22℃恒溫條件下，用振蕩或旋轉(zhuǎn)式保存的時(shí)間僅為5 d，不僅大大限制了血小板的應(yīng)用，而且其保存的溫濕度條件也正是細(xì)菌繁殖的最適條件，易發(fā)生污染甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的輸注事故發(fā)生〔3-4〕。多年來許多學(xué)者致力于尋找一種能有效保存血小板的方法。大量的研究表明深低溫保存可降低血小板代謝，抑止細(xì)菌生長，既延長了保存時(shí)間，又減少了細(xì)菌污染。為長期保存血小板提供了幫助〔5〕。深低溫保存血小板所帶來的一個(gè)問題是凍存和復(fù)溫過程中，由于冰晶的形成與生長、冰晶的再結(jié)晶、高滲壓力和溶質(zhì)的高濃度毒性等有害因素，使血小板遭到不可逆的損傷而死亡。因此，深低溫保存血小板的過程中必須使用冷凍保護(hù)劑（CPA）。由于DNSO有細(xì)胞毒性低、分子量小、強(qiáng)滲透性、易于穿透細(xì)胞、可使冰點(diǎn)下降、提高胞膜對水的通透性、減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成等諸多優(yōu)勢〔6〕，使其成為血小板冰凍保存的首選，目前研究中也多選用5%～6%的DMSO作為CPS〔7-9〕。

賴東生等〔10〕報(bào)道DMSO終濃度達(dá)到制備冰凍血小板要求的5%時(shí)，聚集功能的抵制顯著，其聚集的強(qiáng)度接近零。國內(nèi)孔令魁等〔11〕觀察到22℃保存的液體血小板隨保存時(shí)間的延長其聚集功能逐漸下降，且下降進(jìn)程呈加快的趨勢，推測新鮮血小板在常溫保存期間可能發(fā)生代謝損傷。而對5%DMSO和-80℃條件下的凍存血小板進(jìn)行了長達(dá)5年的跟蹤觀察，其體外聚集功能并沒有發(fā)生顯著改變。我們的研究也觀察到采用終濃度5%的DMSO，在-80℃條件下保存1月，冰凍前后血小板的聚集率和聚集時(shí)間變化率都較為穩(wěn)定，最大聚集率（PAG）有輕微下降，而聚集斜度（S lope）變化不大，部分時(shí)間段里冰凍血小板的聚集斜度更大，特別是血小板聚集的中前期。綜上所述，深低溫加終濃度5%DMSO凍存血小板可以有效抑制血小板在常溫保存過程中的代謝損傷，凍存過程中所有潛在的致血小板活化步驟或因素并沒有明顯影響到血小板的聚集功能。

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〔11〕孔令魁，朱為剛，熊文，等.機(jī)采濃血小板-80℃長期凍存的動態(tài)的體外粘附、聚集功能和Ⅲ因子活性變化〔J〕第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（17）：1898-1800.

（責(zé)任編輯 張 煥）

Effect of the Platelet Aggregation Function after Cryopreservation at-80℃

HE Lijuan1，DENGWeibin2，LIYongping1
（1.Affiliated Hospital of DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000，China;2.The Second Hospital of Jiaxing,Jiaxing,Zhejiang 314000,China）

Objective:A preliminary study of the effect of platelet aggregation function cryopreservation at-80℃.MethodsFresh blood were obtained from the health donors,platelet-rich plasma （PRP）were prepared after centrifugation.Platelet aggregation was measured by platelet aggregationmachine.Then,the platelet samples were cold preserved at-80℃after added with protective agent DMSO （5%DMSO）.One month later,the platelet aggregation was measured again after rapid recovery.ResultsThe platelet aggregation rate（PAG）and the change of aggregation rate per unit time are not statistically significant difference（P>0.05）before and after the cold preservation.ConclusionAfter cold preservation under the condition of 5%DMSO,-80℃for 1 month,platelet aggregation function retained stability.

platelet;cryopreservation;aggregation function

R457

A

1672-2345（2010）12-0035-03

大理學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目（2007X11）

2010-10-28

何麗娟，主治醫(yī)師，主要從事血液病學(xué)研究.

*通信作者：李永萍，教授，電話：13608829819.