桂枝芍藥知母湯對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究

余闐 卿茂盛 肖偉

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性自身免疫性的炎癥性關(guān)節(jié)病，其病理基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)滑膜炎，后期致滑膜增厚，骨與軟骨組織受損。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的關(guān)節(jié)軟骨和骨組織損害，與滑膜細(xì)胞的過度增生活化與凋亡不足密切相關(guān)[1]。研究表明，RA患者滑膜組織和成纖維樣滑膜細(xì)胞中Fas／FasL減少或突變、細(xì)胞因子和Bcl-2表達(dá)增加、p53突變等，從而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞及滑膜細(xì)胞凋亡不足，表現(xiàn)為抑制凋亡和誘導(dǎo)凋亡免疫穩(wěn)態(tài)失衡的病理改變[2]。

桂枝芍藥知母湯始見于張仲景《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治第五》，歷代醫(yī)家均將其作為治療痹證的主方在臨床廣泛應(yīng)用。本研究試圖探討桂枝芍藥知母湯對(duì)RA大鼠滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的影響及對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因的影響。

1 材料與方法

1.1 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.1.1 動(dòng)物造模與分組 選取清潔級(jí)Wistar大鼠30只，體重50～100g，用0.1mmol/L醋酸溶解Ⅱ型膠原蛋白(2mg/mL，4℃，過夜)，再與等量的弗氏完全佐劑混合，于冰浴中充分乳化，除正常組外，每只大鼠尾根部皮下多點(diǎn)注射膠原蛋白0.2mg。造模后10d將動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組和治療組各10只。

1.1.2 桂枝芍藥知母湯方藥 桂枝，白芍，炙甘草，麻黃，知母，白術(shù)，炮附子，生姜。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.3.1 動(dòng)物灌胃藥物及取材 將桂枝芍藥知母湯按常規(guī)方法煎煮濃縮成含生藥1kg/L，4℃保存?zhèn)溆?。造模后?0天治療組大鼠灌服桂枝芍藥知母湯制劑11g/(kg·d)，正常組灌服生理鹽水，每日一次；對(duì)照組每6天予灌服一次MTX混懸液5mg/kg。連續(xù)飼養(yǎng)36d，均斷頭處死。取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，一部分用福爾馬林固定、包埋、切片，留待原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)；另一部分經(jīng)Boin’s液固定1周后，組織脫水，常規(guī)石臘包埋、切片，留待細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因檢測(cè)。

1.1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)

①普通光鏡觀察 HE染色觀察滑膜細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察。

②透射電鏡觀察 滑膜細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察。

③原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(堿性磷酸酶標(biāo)記法)。操作過程：a)脫臘(預(yù)加熱60℃)到PBS溶液，劃圈。b)0.1%檸檬酸鈉Trition孵育8min。c)PBS漂洗2min×2次。d)加紫色瓶50μL標(biāo)記混合物37℃孵育1h。e)PBS漂洗2min×2次。f)加黃蓋瓶中50μL轉(zhuǎn)換液37℃孵育30min。g)PBS漂洗3min×3次。h)加50μL顯色液顯色5～10min，PBS漂洗3次。g核快紅復(fù)染核一兩分鐘，PBS漂洗，水溶性封片劑直接封片，60℃烘干。陰性對(duì)照：只加標(biāo)記溶液代替核苷酸反應(yīng)液。

檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果判定：在滑膜組織中，凋亡細(xì)胞呈深藍(lán)或青紫色，每張切片沿滑膜組織帶計(jì)算400倍視野中細(xì)胞的凋亡數(shù)，計(jì)數(shù)5～10個(gè)視野，標(biāo)出每個(gè)視野平均細(xì)胞凋亡數(shù)。

④細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因，SP法檢測(cè)Fas抗原、Bcl-2蛋白、p53蛋白。操作過程：a)室溫封閉20min，洗3次。b)將切片浸入0.01M枸椽酸緩沖液(pH6.0)、電爐加熱至沸騰2min后，間隔5min，反復(fù)1次，冷卻后PBS洗2次。c)滴加正常山羊血清封閉液，室溫封閉30min。d)滴加1∶100(10mL+1mL PBS)兔抗人Fas、Bcl-2-抗、P53-抗，4℃過夜，PBS洗2min×3次。e)滴加鏈霉素卵白素(SABC)，室溫下30min，PBS洗3次。f)DAB顯色20min。g)常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1 建立RA動(dòng)物模型 選取清潔級(jí)Wistar大鼠30只，體重50～100g，用0.1mmol/L醋酸溶解Ⅱ型膠原蛋白(2mg/mL，4℃過夜)，再與等量的弗氏完全佐劑混合，于冰浴中充分乳化，除正常組外，每只大鼠尾根部皮下多點(diǎn)注射膠原蛋白0.2mg。

1.2.2 動(dòng)物分組、灌胃藥物及取材 造模后第10天將動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組和治療組各10只，將桂枝芍藥知母湯按常規(guī)方法煎煮濃縮成含生藥1kg/L，4℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)組灌服桂枝芍藥知母湯制劑11g/(kg·d)，正常組、對(duì)照組灌服等量生理鹽水，每日一次，連續(xù)飼養(yǎng)36d，斷頭處死，仰位固定。于膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，可見平滑光亮的滑膜組織，用手術(shù)刀分離關(guān)節(jié)的滑膜層和纖維層，然后取出滑膜層組織，每一只大鼠可采集雙側(cè)滑膜組織約15～20mg。將滑膜組織作連續(xù)切片和HE染色進(jìn)行鑒定，不應(yīng)含有軟骨細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。

1.2.3 滑膜細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 無菌操作取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剪成1mm3大小后加入4ml0.4mg/mL的Ⅱ型膠原酶(溶于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，于37℃、5%CO2條件下孵育3h，離心收集未貼壁的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于含有15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)基活力大于95%；分離的滑膜細(xì)胞經(jīng)涂片和Giemsa染色，高倍鏡下計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，其純度為95%以上。

1.2.4 藥物血清的制備 將桂枝芍藥知母湯按常規(guī)方法煎煮濃縮成含生藥1kg/L，4℃保存?zhèn)溆谩Ｇ鍧嵓?jí)Wistar大鼠10只，分為兩組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組灌服桂枝芍藥知母湯制劑11g/(kg·d)，對(duì)照組灌服等量生理鹽水，連續(xù)灌藥10d，于最后一次灌藥后2h腹主動(dòng)脈放血，無菌分離血清，以56℃、30min滅活處理后，0.45μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃凍存?zhèn)溆?。給藥劑量：在體試驗(yàn)的給藥劑量可按體表面積直接計(jì)算法換算動(dòng)物和人之間的劑量。實(shí)際每次給藥劑量=在體試驗(yàn)的給藥劑量×反應(yīng)系統(tǒng)中被稀釋的倍數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞分組并加入藥物血清 將細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照、空白血清和中藥血清組。分別加入培養(yǎng)液、空白血清和中藥血清后繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后進(jìn)行效應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用方差分析。

1.2.6 檢測(cè)指標(biāo) ①掃描電鏡，體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。②流式細(xì)胞儀，將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液用酒精固定，PI染色后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。③DNA凝膠電泳，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。④細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因，SP法檢測(cè)Fas抗原、Bcl-2蛋白、p53蛋白。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 見表1～3。

組織學(xué)改變①電鏡觀察:實(shí)驗(yàn)組可見細(xì)胞體變圓、胞漿量減少、胞核不規(guī)則及核染色質(zhì)濃縮，胞膜完整，并可見凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)改變。②流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果:凋亡細(xì)胞增加幅度實(shí)驗(yàn)組最明顯，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及正常組增加幅度比較均有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 體外實(shí)驗(yàn) 見表4～6。

組織學(xué)改變①電鏡觀察:可見細(xì)胞體變圓、胞漿量減少、胞核不規(guī)則及核染色質(zhì)濃縮，胞膜完整，并可見凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)改變。②流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果:加藥后凋亡細(xì)胞增加幅度中藥血清組最明顯，中藥血清組與空白對(duì)照組及空白血清組增加幅度比較均有顯著性差異(P＜0.01)。③DNA凝膠電泳法檢測(cè)結(jié)果:可見典型的細(xì)胞凋亡“梯狀”電泳帶。

3 討論

桂枝芍藥知母湯是《金匱要略》中的名方，具有祛風(fēng)散寒除濕、溫陽行痹和柔筋定痛等功效。本方溫而不傷陰，如晨僵、關(guān)節(jié)腫痛、血沉、C反應(yīng)蛋白等臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均有明顯改善，有較好的消炎、鎮(zhèn)痛及消腫等作用[3-5]。

表1 各組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和P53表達(dá)的結(jié)果±s)

表1 各組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和P53表達(dá)的結(jié)果±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，ΔP＜0.05。

組別 例數(shù) 凋亡細(xì)胞數(shù)/每視野 P53表達(dá)積分正常組 10 0.73±0.36 0.21±0.11對(duì)照組 10 3.25±0.97* 1.94±0.78*實(shí)驗(yàn)組 10 9.41±5.33*Δ 0.34±0.27Δ

表2 各組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和Bcl-2蛋白表達(dá)的結(jié)果

表3 各組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和Fas表達(dá)的結(jié)果

Bcl-2是一個(gè)定位于核膜、部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜的癌蛋白，可保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，并可特異的抑制P53介導(dǎo)的凋亡及生長(zhǎng)抑制[6]；Fas是細(xì)胞表面的蛋白受體分子，分布于多種組織細(xì)胞，參與清除機(jī)體中被外來微生物感染的細(xì)胞和機(jī)體不再需要的細(xì)胞[7]；而P53是一種腫瘤抑制蛋白，可抑制細(xì)胞增殖和激活細(xì)胞凋亡，但突變型P53蛋白失去原有的抑癌功能，同時(shí)與野生型P53蛋白結(jié)合后可導(dǎo)致機(jī)體自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗P53抗體[8]。

從本實(shí)驗(yàn)可得出，桂枝芍藥知母湯濃縮液可明顯減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜增殖的病理改變，其作用是可能通過減弱大鼠滑膜細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)，而提高Fas的表達(dá)，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞調(diào)亡，從而恢復(fù)細(xì)胞增生與凋亡的平衡。對(duì)照組P53蛋白的表達(dá)較正常組和治療組增高，說明桂枝芍藥知母湯治療RA可能是通過抑制突變型p53的表達(dá)抑制滑膜細(xì)胞過度增生并誘導(dǎo)其調(diào)亡，從而發(fā)揮治療作用。

表4 各組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和P53表達(dá)的結(jié)果(±s)

表4 各組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和P53表達(dá)的結(jié)果(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，ΔP＜0.05。

組別 凋亡細(xì)胞數(shù)/每視野 P53表達(dá)空白對(duì)照組 1.01±0.68 0.59±0.32空白血清組 4.51±1.12* 1.60±0.75中藥血清組 10.56±4.96*Δ 0.60±0.89

表5 各組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和Bcl-2蛋白表達(dá)的結(jié)果

表6 各組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡和Fas表達(dá)的結(jié)果

總之，通過桂枝芍藥知母湯對(duì)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型滑膜細(xì)胞凋亡基因調(diào)控體內(nèi)、體外的實(shí)驗(yàn)研究，初步證明了桂枝芍藥知母湯對(duì)RA滑膜細(xì)胞較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用，為臨床上治療RA提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，同時(shí)桂枝芍藥知母湯在誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制非常復(fù)雜，涉及體液、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)中的多種調(diào)節(jié)因子、多種轉(zhuǎn)錄、代謝調(diào)控因素，故還需從其他相關(guān)基因或蛋白表達(dá)方面做進(jìn)一步研究。

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