苦參素抗大鼠肝臟缺血再灌注損傷作用的研究

高鵬

苦參素(matrine)是從豆科植物苦參的干燥根中提取分離精制而得的白色結(jié)晶性單體粉末。已有研究表明苦參素具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、減輕肝臟炎癥活動、抑制肝內(nèi)膠原合成及抗纖維化作用[1-2]。本實驗通過大鼠肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)模型，探討苦參素對缺血再灌注肝臟細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與試劑 苦參素注射液購于江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號0511101。Bcl-2、Bax和Caspase-3免疫組織化試劑盒購自武漢博士德生物技術公司。

1.2 動物分組與模型建立 8～10周SD大鼠30只，♀♂不限, 體重200～250克。隨機分為空白對照組(S組)、缺血再灌注+生理鹽水組(I/R組)、缺血再灌注+苦參素注射液組(M組)，每組10只。大鼠于術前禁食12h,自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦0.6ml/100g麻醉后，仰臥位固定，行頸部正中切口，鈍性分離出一側(cè)頸內(nèi)動脈，插管以備取血。然后在劍突下行正中腹部切口3～4cm，打開腹腔，暴露肝門，用無損傷血管鉗夾閉門靜脈、肝動脈造成全肝缺血30min后，松夾恢復血流再灌注2h。S組和I/R組于術前30min分別經(jīng)股靜脈輸注生理鹽水2ml/100g，而M組于術前30min經(jīng)股靜脈輸注苦參注射液2ml/100g。術畢處死, 取肝組織置于4%甲醛溶液中固定。

1.3 指標檢測及方法 HE觀察組織超微結(jié)構(gòu)改變：取肝組織左葉剪成0.5cm×0.3cm×1.0cm置于4%甲醛溶液中固定24h后，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，切成4～6um的切片，HE染色，中性膠封固，顯微鏡觀察。

Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達檢測:石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后,滴加3%H2O2滅活內(nèi)源性酶, 雙蒸水漂洗3次后,進行熱修復抗原、滴加抗原修復液Ⅰ和正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min后，切片分別滴加Caspase-3及Bax、Bcl-2單克隆抗體，37℃孵育60min,同樣以PBS漂洗2分鐘×3次,再滴加生物素化羊抗小鼠IgG37℃孵育20min其間以PBS漂洗2分鐘×3次。接著滴加SABC37℃孵育20min其間以PBS漂洗5分鐘×4次。最后以DAB顯色,蘇木素復染后,封片光鏡下觀察。用PBS做陰性對照。結(jié)果判定：細胞漿內(nèi)和細胞核膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒或勻質(zhì)樣棕黃色結(jié)構(gòu)為Caspase-3、Bcl-2和Bax免疫反應陽性細胞。各例切片于光鏡下觀察10個高倍視野，用BI2000醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)測定每組Caspase-3、Bcl-2和Bax平均光密度值(OD值)。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下見S組肝小葉、肝細胞、枯否氏細胞及竇內(nèi)皮細胞形態(tài)正常，竇間隙清晰可見。I/R組肝細胞大小不一，小葉周邊竇間隙變窄，甚至消失，肝細胞脂肪變性非常明顯。M組肝臟較I/R組明顯減輕，偶見水腫、變性，小葉周邊竇間隙清晰可見。

2.2 免疫組化法檢測Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達鏡下觀察表明，凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3主要在肝臟細胞的胞漿表達,呈棕色反應,胞核基本不表達。M組Bax OD值明顯低于I/R組(P＜0.05)，略微高于S組(P＞0.05)，而I/R組Bax OD值顯著高于S組(P＜0.01)；I/R組Bcl-2 OD值高于S組(P＜0.05)，且M組Bcl-2 OD值高于S組(P＜0.05)，M組中Bcl-2表達雖強于I/R組,但兩組之間比較差異無顯著性; I/R組Caspase-3 OD值明顯高于S組(P＜0.01)，且明顯高于M組(P＜0.01)(見表1) 。

表1 各組中Bax、Bcl-2和Caspase-3 OD值比較

3 討論

HIRI是肝部分切除及肝移植的主要制約因素之一[3],是導致患者死亡的主要原因。它是指各種原因?qū)е赂窝髦袛嗷虿蛔闶垢闻K缺血，當恢復血供再灌注后，肝細胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重。本實驗HIRI模型通過阻斷全肝血流30min后恢復血流造成肝臟的損傷，從而出現(xiàn)肝細胞的變性和壞死。資料顯示[4]，HIRI與內(nèi)皮素/一氧化氮的失衡，核因子-kB(NF-kB)的激活，前炎性因子和粘附因子的釋放，氧源性自由基的產(chǎn)生和中性粒細胞的聚集，肝細胞凋亡等因素密切相關。

以往認為壞死是HIRI后細胞死亡的唯一方式，近年來,大量研究資料表明，引起細胞死亡的方式可通過凋亡和壞死兩條途徑。凋亡是HIRI后細胞死亡的主要方式，HIRI后細胞凋亡的發(fā)生與缺血的嚴重程度、再灌注時間的長短有關。再灌注能加速細胞凋亡的進程。目前人們對HIRI時細胞凋亡的發(fā)生機制研究頗多，尤其是多種基因參與細胞凋亡的調(diào)控如bcl-2家族、Caspase家族、TNF受體家族和即早基因(IEGS)家族等。研究表明[5]，脂質(zhì)過氧化、Bcl-2/Bax和Caspase-3參與肝臟缺血再灌注后細胞損傷過程，并在其中起重要作用。Bcl-2的功能可被結(jié)合蛋白所改變，Bax蛋白是同一細胞內(nèi)Bcl-2的同源基因，二者作用相互拮抗。Bax可與Bcl-2蛋白結(jié)合成異二聚體并使之失活，加強表達Bax形成同二聚體將加速細胞死亡。所以Bcl-2和Bax表達水平的平衡結(jié)果決定了凋亡信號刺激后細胞存活或凋亡。而Caspase-3是細胞凋亡的效應分子,它在各種生理和病理因素刺激下,通過其家族成員的級聯(lián)放大,實施細胞的凋亡, 引起細胞特征性的凋亡形態(tài)學上的改變,加重組織或器官的功能損害。有研究發(fā)現(xiàn)，HIRI后Bcl-2表達減弱，Bax表達增強，Bcl-2/Bax下降，表明Bcl-2、Bax參與了肝臟保存再灌注中細胞凋亡的調(diào)控。因此，通過抑制缺血再灌注過程中細胞凋亡能夠保護肝臟功能?？鄥⑺叵涤芍兴幙喽棺又刑崛〉纳飰A類，大量研究表明，苦參素有抗HBV作用[6-7]，能消除自由基、保護免疫功能、抗細胞纖維化作用[1-2]。本研究證實：I/R組Bcl-2表達減弱，Bax表達增強，Bcl-2/Bax下降；苦參素組能使Bcl-2表達增強，Bax表達降低，Caspase-3表達也明顯減弱，提示該藥具有抑制肝細胞凋亡和改善肝功能作用，有利于預防HIRI。鑒于苦參素無明顯毒副作用，有望成為很有前途的保護肝臟藥物，其臨床療效還有待進一步深入研究。

[1]施光峰,李謙,翁心華,等.苦參素對大鼠纖維化肝臟組織金屬蛋白酶抑制因子-1、α-平滑肌肌動蛋白表達的影響[J].實用肝臟病雜志,2003,6(3):132-134.

[2]王俊學,王國俊,蔡雄,等.氧化苦參堿對TNFα誘導的人L02肝細胞凋亡的影響[J].肝臟,2001,6:83.

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[5]高鵬,張定國,陸小華.大鼠肝臟缺血再灌注損傷對脂質(zhì)過氧化和Bcl-2/Bax表達的影響[J].肝臟,2006,11(3):186-187.

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[7]潘正順,余瓊?cè)A,嚴鴻,等.苦參素聯(lián)合干擾素α-1b治療慢性乙型肝炎的臨床研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(8):700-703.