運(yùn)用益氣方調(diào)節(jié)化療所致紅細(xì)胞減少癥的作用機(jī)理研究

郭 焱，蘇 穎，顧紅纓，李春子，李 欣，朱 娜

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

腫瘤患者術(shù)后放化療造成的毒副作用嚴(yán)重影響術(shù)后治療與康復(fù)，特別是血中紅細(xì)胞等明顯減少對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此，采取有效措施防治放化療的毒副反應(yīng)，越來越引起廣泛關(guān)注［1］。紅細(xì)胞在防御系統(tǒng)（即免疫系統(tǒng)）中的重要地位，近年來逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。1981年美國(guó)學(xué)者西格爾（siegel）總結(jié)了許多學(xué)者的研究成果，提出紅細(xì)胞也參與人體的防御工作，是人體免疫系統(tǒng)的一部分。近些年來研究表明，紅細(xì)胞也是一類免疫細(xì)胞。紅細(xì)胞免疫功能是藉助其膜表面分子 （如 CR1、CR3、CD58、CD59、DAF、SOD酶等）的免疫黏附作用，根據(jù)這樣的原理我們可以檢測(cè)紅細(xì)胞和血紅蛋白中紅細(xì)胞的水平來間接表明機(jī)體的免疫功能情況。紅細(xì)胞（RBC）Csb受體花環(huán)：RBC膜上Cb受體可與C3b致敏酵母多糖黏附形成花環(huán)；RBC免疫復(fù)合物（IC）花環(huán)：RBC膜黏附的IC中C3b分子可與酵母多糖黏附形成花環(huán)［2］。免疫酶標(biāo)記技術(shù)是把抗原體的免疫反應(yīng)和酶的高度催化作用有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來的一種免疫學(xué)分析技術(shù)。試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）水平。本研究基于中醫(yī)氣血相生理論，根據(jù)臨床治療放化療所致紅細(xì)胞減少癥的有效驗(yàn)方，探討益氣方調(diào)節(jié)化療所致紅細(xì)胞減少癥的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，體重18 g～22 g，SPF級(jí)，雌雄各半，由本校基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 藥物與試劑 益氣方是根據(jù)藥典配方調(diào)配，常規(guī)煎藥、過濾，飲片由本校附屬醫(yī)院提供。環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CY）：每支 200 mg，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：04090321。EDTA-2Na：規(guī)格100 g，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。氯化鈉注射液：內(nèi)蒙古康源藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：09080405。磷酸氫二鈉（無水）：規(guī)格 500 g，北京紅星化工廠生產(chǎn)。磷酸氫二鉀：規(guī)格500 g，天津市化學(xué)試劑第二廠生產(chǎn)。沙保氏瓊脂：規(guī)格500 g，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20070328。瓊脂粉：規(guī)格500 g，天津市化學(xué)試劑六廠三分廠生產(chǎn)，批號(hào)：2003913。肝素鈉抗凝劑：規(guī)格12 500 U/支，上海生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn)。小鼠紅細(xì)胞刺激因子（ESF）試劑盒：美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 取ICR小鼠50只，隨機(jī)分為模型組、正常對(duì)照組、益氣方高劑量組（高劑量組）、益氣方中劑量組（中劑量組）、益氣方低劑量組（低劑量組），每組10只，雌雄各半。動(dòng)物室室溫19℃～21℃，相對(duì)濕度40%～60%，每日光照12 h，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物可自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件符合GB1495-94國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。給藥組小鼠按劑量分別灌胃給藥，各組給藥劑量均按小鼠臨床等效劑量計(jì)算所得［3］。正常對(duì)照組與模型組小鼠同時(shí)灌服等容量生理鹽水，連續(xù)15 d，給藥體積為30 mL/kg體重，每日給藥1次。從第8天起模型組與各治療組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，連續(xù)3 d［4］，正常對(duì)照組小鼠同時(shí)注射等體積生理鹽水。

1.2.2 小鼠紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)和免疫復(fù)合物花環(huán)實(shí)驗(yàn)［5］制備待測(cè)紅細(xì)胞懸液：將肝素抗凝的指血或靜脈血用生理鹽水洗滌離心3次，2 000 r/min離心3 min～5 min，計(jì)數(shù)后配成1.25×107/mL紅細(xì)胞懸液備用；補(bǔ)體致敏的酵母菌試劑：將酵母菌用生理鹽水洗滌3次后，配成1%懸液，置水浴內(nèi)煮沸20 min，充分混勻；用二層定性濾紙（或16層紗布）過濾，除去小凝塊，在低倍鏡下呈單個(gè)酵母菌細(xì)胞分散狀態(tài)；加等量小鼠血清，混勻后置37℃水浴致敏15 min，用生理鹽水洗滌1次，2 500 r/min離心10 min，去上清，用生理鹽水重混懸，計(jì)數(shù)后配成1×108/mL補(bǔ)體致敏的酵母菌懸液。取兩支小試管，每管加待測(cè)紅細(xì)胞懸液100 μL，第一管再加補(bǔ)體致敏酵母菌懸液100 μL，第二管加未致敏的酵母菌懸液100 μL，搖勻放37℃水浴30 min；取出用手腕輕輕搖勻，加生理鹽水 200 μL；混勻后，再加 0.25%戊二醛 75 μL 并輕輕混勻；分別取1/3量水平涂片、吹干，加甲醇固定；用瑞氏法染色，油鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.3 小鼠紅細(xì)胞和血紅蛋白水平的測(cè)定 于第15天末次給藥20 h后小鼠眼球取血0.5 mL，加入2%EDTA-Na2固體抗凝劑100 μL抗凝，上全自動(dòng)血液分析儀分析紅細(xì)胞和血紅蛋白水平。

1.2.4 小鼠紅細(xì)胞集落刺激因子的測(cè)定 用ELISA法檢測(cè)小鼠外周血ESF水平，小鼠眼球取血0.6 mL，3000 r/min，離心30 min分離血清，放置-20℃冰箱保存，進(jìn)行小鼠紅細(xì)胞集落刺激因子的酶聯(lián)反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)和免疫復(fù)合物花環(huán)實(shí)驗(yàn)

與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺模型鼠RBCC3bRR降低，RBC-ICR升高，證明造模成功。與模型組比較，服用益氣方小鼠RBC-C3bRR升高，RBCICR降低，特別是益氣方中劑量組RBC-C3bRR顯著升高，RBC-ICR顯著降低，表明益氣方使CY化療小鼠的紅細(xì)胞免疫黏附功能上升，以中劑量療效最佳。結(jié)果見圖1。

2.2 小鼠紅細(xì)胞和血紅蛋白水平檢測(cè)

CY具有細(xì)胞毒性，能抑制細(xì)胞分裂，致骨髓造血功能損壞，引發(fā)多系血細(xì)胞數(shù)量減少。實(shí)驗(yàn)表明，注射環(huán)磷酰胺后，小鼠的紅細(xì)胞及WBC、HGB各項(xiàng)指標(biāo)均顯著低于正常小鼠，表明其處于免疫抑制狀態(tài)。注射環(huán)磷酰胺并灌服益氣方的小鼠外周血象較模型組小鼠明顯提高，紅細(xì)胞和血紅蛋白有所增加，說明益氣方對(duì)CY所致骨髓造血功能損傷有拮抗作用，并可恢復(fù)或改善機(jī)體免疫功能。益氣方中劑量組上述各項(xiàng)指標(biāo)顯著增高，提示益氣方可以抵消環(huán)磷酰胺引起的紅細(xì)胞減少及細(xì)胞免疫損傷，使免疫損傷小鼠的紅細(xì)胞數(shù)目增加，增強(qiáng)細(xì)胞的應(yīng)答能力，對(duì)機(jī)體低下的細(xì)胞免疫具有一定的恢復(fù)作用。結(jié)果見圖2。

2.3 小鼠紅細(xì)胞集落刺激因子水平的測(cè)定

以ELISA法測(cè)定小鼠紅細(xì)胞集落刺激因子，與模型組比較，各給藥組小鼠紅細(xì)胞集落刺激因子濃度升高，中劑量組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。說明益氣方可拮抗化療所致小鼠紅細(xì)胞減少。結(jié)果見圖3。

3 討 論

近年來研究表明紅細(xì)胞是不可忽視的免疫細(xì)胞，與白細(xì)胞一樣具有重要的免疫功能。紅細(xì)胞受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)，具有識(shí)別、黏附、殺傷抗原、清除免疫復(fù)合物（IC）［6］、參與機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫調(diào)控的功能，而且參與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。紅細(xì)胞的免疫物質(zhì)主要為存在于紅細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子，其中C3b受體數(shù)量占血液循環(huán)總數(shù)的95%以上，機(jī)體清除循環(huán)免疫復(fù)合物主要靠紅細(xì)胞［7］。

研究結(jié)果顯示服用益氣方小鼠RBC-C3bRR比模型組顯著升高，RBC-ICR顯著降低，表明其紅細(xì)胞免疫黏附功能上升，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8］。作用機(jī)理為模型組紅細(xì)胞攜帶免疫復(fù)合物增加，使紅細(xì)胞C3b受體空位減少（表現(xiàn)在紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率下降，CR1活性下降），免疫黏附的IC不易清除，而服用益氣方的小鼠紅細(xì)胞攜帶免疫復(fù)合物降低。細(xì)胞因子（CK）是由活化免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞（如某些基質(zhì)細(xì)胞）合成分泌的能調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能、參與免疫應(yīng)答和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)的小分子多肽或糖蛋白，是不同于免疫球蛋白和補(bǔ)體的又一類免疫分子，細(xì)胞因子存在的情況下，可以刺激紅細(xì)胞生成。ELISA實(shí)驗(yàn)中的雙抗夾心的原理，進(jìn)一步說明益氣方對(duì)化療后小鼠紅細(xì)胞減少癥有作用［9］。益氣方中的人參具有抗休克、抗疲勞、降血糖、促進(jìn)造血系統(tǒng)的功能、減輕化療藥物對(duì)造血系統(tǒng)的損傷等作用，能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。人參屬補(bǔ)氣藥，中醫(yī)理論認(rèn)為，氣能統(tǒng)攝血液，補(bǔ)氣可以生血生津。黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、促進(jìn)血清和肝臟蛋白質(zhì)的更新、穩(wěn)定紅細(xì)胞膜、提高血漿組織內(nèi)c-AMP的含量、增強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)再生肝DNA合成等多種作用。

益氣方劑對(duì)環(huán)磷酰胺所致的小鼠紅細(xì)胞減少癥具有一定的治療作用，提示益氣方可作為腫瘤化療、放療患者的輔助治療藥物［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中劑量治療組效果最為顯著，高劑量治療組次之，低劑量治療組效果不明顯，有關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究闡明。

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