甘草酸提取與精制工藝優(yōu)化

佘金明 , 劉有勢(shì), 謝顯珍, 梁逸曾

(1. 中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院中藥現(xiàn)代化研究中心, 長(zhǎng)沙 410083; 2. 湖南工業(yè)大學(xué) 科技學(xué)院, 湖南 株洲 412008; 3. 常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系, 湖南 常德 415000)

甘草酸提取與精制工藝優(yōu)化

佘金明1,3, 劉有勢(shì)2, 謝顯珍3, 梁逸曾1

(1. 中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院中藥現(xiàn)代化研究中心, 長(zhǎng)沙 410083; 2. 湖南工業(yè)大學(xué) 科技學(xué)院, 湖南 株洲 412008; 3. 常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系, 湖南 常德 415000)

采用氨性乙醇溶液從甘草中提取甘草酸, 以甘草酸含量為指標(biāo), 結(jié)合單因素研究的結(jié)果, 運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)提取溫度、料液比和酸沉pH值等因素進(jìn)行工藝優(yōu)化; 再通過靜態(tài)吸附、動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn), 篩選出D-101型大孔樹脂及純化的最佳工藝條件, 為甘草酸的提取與精制提供理論依據(jù).

甘草酸; 正交試驗(yàn); 提取精制; 大孔樹脂

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

1.1.1 原輔試劑

烏拉爾甘草(新疆阜康烏拉爾甘草種植有限公司), D-101、AB-8、DA-301、DA-201等大孔樹脂(天津市海光化工有限公司), 氨水、乙醇、活性炭等藥品均為分析純.

1.1.2 儀器設(shè)備

FW135微型粉碎機(jī)(上海安銳自動(dòng)化儀表有限公司), 800-1離心機(jī)(北京惠智儀誠科研發(fā)展有限公司), RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司), SHB-3真空抽氣裝置(河南太康科教儀器廠), JA5103N型分析天平(上海達(dá)平儀器有限公司), DZKW-4恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司), UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甘草酸的提取

采用熱回流裝置, 用氨性醇溶劑從甘草中提取甘草酸. 在500 mL的三口燒瓶中, 加入50 g過2號(hào)篩的甘草細(xì)粉末, 加入規(guī)定量的提取液, 混合浸漬1 h, 連接冷凝管、抽氣裝置等. 在設(shè)定溫度下恒溫水浴加熱規(guī)定時(shí)間后, 停止加熱, 趁熱抽濾, 將濾液離心并取上層清液, 再用相同方法對(duì)甘草濾渣進(jìn)行第2次提取(溶劑、時(shí)間為原來的2/3). 合并兩次離心后所得的溶液, 于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的1/5, 用3.0 mol? L-1的H2SO4調(diào)節(jié)濃縮后溶液的pH值到規(guī)定范圍, 低溫靜置待甘草酸沉淀不再增加為止, 抽濾, 用蒸餾水潤洗2次, 干燥至恒重, 得到棕黃色甘草酸粉末粗品, 并用分析天平稱其質(zhì)量.

1.2.2 甘草酸的精制

大孔吸附樹脂法[11]是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新工藝, 已廣泛應(yīng)用于天然藥物的分離與純化,成為精制有機(jī)化合物尤其是水溶性化合物的有效手段. 它具有吸附容量大、再生簡(jiǎn)單、效果可靠等特點(diǎn),是一種較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法. 通常選用的樹脂有Amblite XAD4, XAD8, XAD9, XAD11, DA201, AB-8和D101等類型. 其基本的工藝流程[12]為:

提取粗品→熱水溶解→調(diào)pH值→上柱吸附→水或稀醇洗脫→濃縮→脫色→重結(jié)晶→純品.

1.2.3 甘草酸的含量測(cè)定

甘草酸含量的測(cè)定方法很多, 有重量法、比色法、紫外-可見分光光度法等傳統(tǒng)方法及高效液相色譜法(HPLC)、薄層掃描法(TLC)、氣相色譜法(GC)和毛細(xì)管電泳法(CE)等現(xiàn)代方法[13]. 本實(shí)驗(yàn)采用重量法和紫外-可見分光光度法測(cè)定甘草中甘草酸的含量.

重量法: 甘草酸% = (精制后的甘草酸質(zhì)量/甘草細(xì)粉的質(zhì)量)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對(duì)甘草酸提取的影響

通過考查相關(guān)資料, 確定氨水濃度(0.5%)、乙醇濃度(40%)、提取時(shí)間(2 h)、甘草顆粒大小(過2號(hào)篩)、溫度(60℃)、料液比W/V(1:10)、酸沉pH(1.5)值等作為考查單因素影響提取效果時(shí)的固定條件. 每次取過篩后的甘草粉末50 g按1.2.1的方法提取甘草酸.

2.1.1 氨水濃度

在上述條件中, 將氨作為變量, 其它因素不變, 結(jié)果如圖1所示. 在溶劑水中加入氨, 改變了甘草酸的電離狀態(tài), 從而增加甘草酸的水溶性. 當(dāng)氨水濃度上升至0.5%以后, 隨著濃度升高, 產(chǎn)率增加緩慢, 當(dāng)超過0.75%時(shí), 產(chǎn)率逐漸降低, 并有氨氣向外逸出, 造成環(huán)境污染. 所以氨水的加入有利于甘草酸的提取, 其濃度在0.1～0.8%范圍內(nèi)對(duì)甘草酸的影響較大, 但不宜過高, 以0.5%左右適宜.

2.1.2 乙醇濃度

如果將乙醇作為變量, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示. 在溶劑水中加入乙醇, 引起提取溶劑物理性質(zhì)(如極性、密度、粘度及介電常數(shù)等)的變化, 尤其是溶劑極性的變化, 從而影響甘草酸的提取. 隨著乙醇濃度的增加, 產(chǎn)率上升, 當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)產(chǎn)率最大. 當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大時(shí), 甘草酸得率下降, 這是由于甘草酸在過高濃度的乙醇中溶解度降低所致, 同時(shí)為了降低其成本, 確定30%作為控制乙醇濃度的最佳條件.

圖1 氨水濃度對(duì)甘草酸提取率的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)甘草酸提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間

時(shí)間作為變量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示. 隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)率增加, 但達(dá)到一定時(shí)間后, 物料內(nèi)部和溶劑中的溶質(zhì)達(dá)到了平衡, 繼續(xù)提取意義不大, 反而增加提取成本. 因此, 提取時(shí)間以2 h為宜.

2.1.4 甘草顆粒大小

甘草粒度對(duì)甘草酸提取率的影響如圖4所示. 其得率隨粒度減小而增加, 因?yàn)槲锪狭６葴p小, 固液兩相接觸面積將增大, 溶劑向甘草原料滲透的速率以及甘草酸從固體顆粒表面向溶劑傳質(zhì)速率都增大. 當(dāng)粒度大于40目后, 得率趨于穩(wěn)定. 因?yàn)榱６葴p小時(shí)其它可溶性成分的溶解速度也增加, 從而使得溶液的粘度增加, 溶液的擴(kuò)散系數(shù)降低, 傳質(zhì)速率減小, 不利于甘草酸的溶出. 綜合考慮, 以過2號(hào)篩的顆粒作為甘草顆粒的大小.

圖3 提取時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響

圖4 甘草粒度大小對(duì)甘草酸提取率的影響

2.2 氨性醇提取法的工藝條件優(yōu)化

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論, 選取提取溫度、料液比、酸沉pH值作主要因素, 以測(cè)得的粗甘草酸收率為考察指標(biāo), 采用L9(34)表安排試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平見表1, 正交試驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3.

表1 因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

從表2中直觀分析, 各因素影響甘草酸提取效率的大小順序?yàn)橐蛩谻＞因素A＞因素B, 其最佳工藝條件為A2B2C2, 與相關(guān)資料中單因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致. 由于各因素的極差與誤差列的極差相差很大,因此各因素間的交互作用誤差可以忽略.即在該實(shí)驗(yàn)過程中, 提取溫度為60℃, 甘草粉末質(zhì)量與溶劑體積比為1:12, 酸沉pH值等于1.5為最佳的實(shí)驗(yàn)條件.

表3中的方差分析結(jié)果顯示, 因素A、B、C對(duì)甘草酸的提取都有非常顯著的影響,其影響的大小程度為:

酸沉pH＞提取溫度＞料液比.

2.3 甘草酸精制的主要影響因素

2.3.1 樹脂的選擇及對(duì)甘草酸的靜態(tài)吸附

大孔吸附樹脂具有吸附性與篩選性,其吸附性是由于范德華力或氫鍵的作用,而篩選是由樹脂本身的孔型結(jié)構(gòu)所決定的. 根據(jù)樹脂骨架材料的不同, 大孔樹脂可以分為極性、弱極性和非極性三大類,吸附和篩選作用以及本身的極性使得大孔吸附樹脂具有吸附、富集、分離不同母核結(jié)構(gòu)化合物的功能[7,14]. 由于大孔吸附樹脂的吸附飽和度會(huì)隨著吸附物質(zhì)的不同而不同, 因此對(duì)選用的吸附樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn), 其結(jié)果如表4.

表4 樹脂對(duì)甘草酸的靜態(tài)吸附解吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在相同條件下大孔樹脂的種類不同,其吸附、解吸能力不一樣. 從吸附量和解吸率來看, 非極性的D-101型大孔樹脂優(yōu)于其它極性不同的樹脂. 因此本課題選用D-101樹脂來純化甘草酸.

2.3.2 影響樹脂對(duì)甘草酸動(dòng)態(tài)吸附的因素

大孔樹脂吸附甘草酸時(shí), 存在著一個(gè)吸附動(dòng)態(tài)平衡, 該平衡和料液濃度、吸附流速及料液pH值等存在很大的關(guān)系. 取粗品甘草酸分別配制成5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/mL的溶液, 進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn).

料液濃度: 取上述濃度的甘草酸樣品溶液通過裝有D-101樹脂的色譜柱, 調(diào)節(jié)pH值為6.0, 吸附流速為2BV/h. 結(jié)果表明, 若上樣液較稀, 則甘草酸液粘度較小, 通過色譜柱時(shí)流速過快, 大于傳質(zhì)速度, 部分甘草酸在達(dá)到飽和之前未被吸附而漏掉; 若上樣液濃度過高, 也會(huì)導(dǎo)致甘草酸吸附不完全. 上樣液中甘草酸在6～8 mg/mL之間比較合適, 其樹脂的吸附能力較強(qiáng), 且吸附量隨著濃度升高而增多.

吸附流速: 為了充分發(fā)揮樹脂的吸附效能, 必須使液固兩相有充分的接觸時(shí)間, 如果物料流速太快,將使固液接觸的時(shí)間縮短, 被吸附物提前流出色譜柱, 使柱效能降低. 通常吸附流速以慢速為好, 但不能太慢, 否則會(huì)造成柱內(nèi)液相的縱向混返, 不利于樹脂的吸附, 同時(shí)將延長(zhǎng)生產(chǎn)周期, 從而提高成本. 綜合考慮, 選擇吸附流速為3 BV/h為宜.

料液pH值: 取7.0 mg/mL的溶液, 吸附流速控制為2BV/h, 分別設(shè)定pH值為4、5、6、7, 收集流出液并測(cè)量, 以TLC板標(biāo)定終點(diǎn), 計(jì)算吸附量. 當(dāng)pH值在4～7之間時(shí), 大孔樹脂的吸附能力都比較好, pH為6.0左右時(shí)其吸附量達(dá)到最大值.

2.3.3 D-101型樹脂洗脫液的選擇對(duì)甘草酸動(dòng)態(tài)解吸的影響

吸附樹脂的解吸是通過改變體系的親水-疏水平衡來調(diào)整控制, 改變?cè)瓉淼奈綏l件, 讓吸附質(zhì)重新由樹脂相進(jìn)入溶液. 解吸劑(又稱洗脫劑)以最能溶解吸附質(zhì)為原則, 因此乙醇為常用解吸甘草酸的樹脂洗脫液.

取3份7.0 mg/mL的甘草酸樣品溶液通過D-101大孔樹脂, 在上述實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附. 再分別用20%、40%、60%的乙醇洗脫, 每通過1BV收集一份洗脫液, 用紫外分光光度法測(cè)量甘草酸含量. 結(jié)果顯示, 3種不同濃度的乙醇對(duì)甘草酸洗脫效果基本相當(dāng), 其最高峰均出現(xiàn)在2BV前后. 當(dāng)洗脫液體積達(dá)4BV時(shí), 20%乙醇的洗脫液中甘草酸含量已經(jīng)接近為零, 而40%、60%乙醇在此體積時(shí)未能洗脫完全, 說明它們的洗脫能力較20%的乙醇弱. 所以甘草酸的洗脫液選擇以4BV和20%的乙醇為最佳條件.

3 結(jié)論

甘草酸粗品提取的最佳工藝條件: 氨水濃度(V/V)為0.5%, 乙醇濃度(V/V)為(40%), 提取時(shí)間2h, 甘草顆粒過2號(hào)篩, 提取溫度為60℃、料液比為1:12, 1.5為酸沉pH值等, 在該條件下甘草酸的提取效率可達(dá)9.86%.在甘草酸的精制過程, 選擇D-101型大孔樹脂作為精制甘草酸的最佳樹脂, 其吸附率和解吸率均較高; 其最佳的工藝條件為: 樹脂量為100 mL, 上樣液中甘草酸的濃度在6～8mg/mL之間, 料液pH值為6.0, 吸附流速為3 BV/h; 選用4 BV和20%的乙醇作為洗脫液; 解吸液濃縮經(jīng)脫色后甘草酸純度高達(dá)89.6%.

隨著中藥現(xiàn)代化、國際化和工業(yè)化的進(jìn)程日益加快, 甘草酸在提取過程中要求快速、完全及高度純化已成為必然. 因此微波、超聲、超臨界等現(xiàn)代提取技術(shù)及雙水相萃取與高速逆流色譜等新型分離手段的應(yīng)用也將成為甘草酸提取、精制方法發(fā)展的主流.

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Optimization on Extraction and Purification Technology of Glycyrrhizic Acid from Liquorice

SHE Jin-ming1,3, LIU You-shi2, XIE Xian-zhen3, LIANG Yi-zeng1
(1. Research Center of Modernization of Chinese Herbal Medicine, College of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083 China; 2. College of Science and Technology, HNUT, Zhuzhou 412008, China; 3. Department of Pharmacy, Changde Vocational and Technical College, Changde 415000, China)

This research uses the ammonia and ethanol solution to extract Glycyrrhizic Acid from Liquorice. Taking the contents of Glycyrrhizic Acid as an index, and considering the result of impel factor test, it optimizes the extraction technology in terms of the temperature, rate of material-liquid and pH of acid precipitation and so on, by implementing the orthogonal experiment. The D-101 macroporous adsorption resin is selected by statical adsorption, the best optimum condition is obtained through dynamic adsorption and desorption experiment. And also, it provides the theoretic basis for the extraction and purification technology of Glycyrrhizic acid.

glycyrrhizic acid; Orthogonal experiment; extraction and purification; macroporous resin

R284.2

A

1672-5298(2010)03-0055-05

甘草(Radix Glycyrrhiza)一般指豆科植物烏拉爾甘草(Glycyrrhizae uralensis Fisch)、脹果甘草(Glycyrrhizae inflate Bat)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L)的干燥根及根莖[1]. 它主要分布在西北、華北、東北地區(qū)[2]. 甘草歷來享有“中草藥之王”的美譽(yù), 具有廣泛的生理活性. 主要用作抗炎、抗病毒、保肝解毒及增強(qiáng)免疫功能等作用[3]. 近年來臨床上還用于治療各種急慢性肝炎、肝纖維化、支氣管炎和艾滋病等疾病[4～6].

甘草主要含有甘草酸(glycyrrhizic acid, 又稱甘草甜素)、甘草次酸、黃酮、生物堿和氨基酸等, 其中甘草酸是最重要的化學(xué)成分和活性組分, 其骨架為齊墩果烷型弱酸, 由于分子中含有多個(gè)羧基、羥基等極性基團(tuán), 它溶于熱水和熱的稀乙醇, 不溶于無水乙醇和乙醚. 實(shí)際上甘草酸在植物體中可能以鉀鹽或鈣鹽的形式存在, 通常甘草酸是指甘草酸及其鹽的通稱, 其含量在4～14%的范圍內(nèi). 在提取過程中加入稀氨水能提高甘草酸的提取效率便是這個(gè)緣故, 因此甘草酸鹽遇酸則生成沉淀, 所以利用此性質(zhì)進(jìn)行提取純化[2,7].

目前甘草酸的提取與精制工藝研究較多. 但每種方法各有利弊. 如傳統(tǒng)的水提取法效率太低, 且產(chǎn)品易于霉變; 單純的氨提取法易造成污染; 而現(xiàn)代微波提取和超聲提取不適宜工業(yè)化的生產(chǎn)[8,9]. 綜合比較,氨性醇提取是一種比較實(shí)用的方法. 關(guān)于甘草酸的精制方法, 主要有超濾法、溶劑法(結(jié)晶法)、樹脂法、聚酰胺法等[10], 工業(yè)生產(chǎn)中主要應(yīng)用溶劑法, 但樹脂法中的大孔樹脂吸附法精制效果好. 本文以甘草酸的粗得率為指標(biāo), 結(jié)合單因素研究的結(jié)果, 運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)提取溫度、料液比, 酸沉pH值等因素進(jìn)行工藝優(yōu)化, 再通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)、動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn), 篩選出大孔吸附樹脂和純化方法的最佳工藝條件,為甘草酸的提取與精制提供依據(jù).

2010-06-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20875104)

佘金明(1966- ), 男, 湖南桃源人, 碩士, 常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系副教授. 主要研究方向: 天然藥物化學(xué)