食用菌液體母種純化技術(shù)

聶建軍，殷海善，李兆斌，王 錚

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源綜合考察研究所，山西太原030006）

食用菌液體菌種是通過液體培養(yǎng)得到的食用菌菌種，簡單地講，是指生長在液體培養(yǎng)基中用于繁殖下一代的菌種或栽培菌絲體，即以菌絲體所存活培養(yǎng)基的存在形態(tài)來命名的[1]。

在菌絲體培養(yǎng)過程中，液體母種（液體培養(yǎng)的斜面母種）是食用菌液體培養(yǎng)的核心環(huán)節(jié)，菌種質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到食用菌栽培的成敗以及其產(chǎn)量的高低和質(zhì)量的好壞。液體培養(yǎng)基由于培養(yǎng)條件與固體培養(yǎng)基有所不同，因此對(duì)菌種有其獨(dú)特的要求。液體培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，分布均勻，溫度、pH等條件適宜，細(xì)菌及其他雜菌在這樣的培養(yǎng)液條件下更易繁殖。通常細(xì)菌繁殖一代只需20～30 min，如果液體培養(yǎng)菌中進(jìn)入一個(gè)細(xì)菌，繁殖15 h后，細(xì)菌數(shù)量可達(dá)到10億個(gè)[2]，這樣大量雜菌會(huì)造成所需制備的液體菌種染菌酸敗。但筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，帶有微量雜菌的菌種接到固體培養(yǎng)基上基本不影響菌種的萌發(fā)和吃料，接入菌瓶或菌袋仍能正常生長。

本研究采用木屑濾菌法和藥物濾菌法（木屑培養(yǎng)基中加0.5%多菌靈），對(duì)用于液體培養(yǎng)的斜面母種進(jìn)行純化，以期達(dá)到液體培養(yǎng)的要求。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

供試菌種為申香6號(hào)香菇（Lentinus edodes），引自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2 菌種培養(yǎng)基

1.2.1 斜面母種PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL，pH 自然[3]。

1.2.2 液體培養(yǎng)基 玉米粉6%，麩皮2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，維生素 B110 mg/L，pH 自然[4]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 液體母種純化 將未純化菌種、木屑濾菌法純化菌種、藥物濾菌法純化菌種、木屑濾菌法和藥物濾菌法純化（高度純化）菌種分別接入PDA斜面試管，25℃下培養(yǎng)12 d。

1.3.2 接種與培養(yǎng) 250 mL三角瓶裝液體培養(yǎng)基40 mL，接入0.5 cm2等量菌塊3塊，使氣生菌絲一面向上懸浮，28℃靜置24h。然后放入往復(fù)式恒溫振蕩器內(nèi)，28℃，150 r/min條件下培養(yǎng)4 d[5]。

1.4 測定方法

1.4.1 菌球數(shù)量測定 用吸管吸取1 mL菌液在玻璃板上攤成薄薄一層，用接種針將菌球分開，直觀計(jì)數(shù)，如此重復(fù)10次，取其平均值。

1.4.2 菌球直徑測定 培養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取10個(gè)菌球排成一排，在玻璃板下襯坐標(biāo)紙測量10個(gè)菌球直徑，重復(fù)3次，然后計(jì)算單個(gè)菌球的平均直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同純化方式菌種在斜面PDA培養(yǎng)基上的表現(xiàn)

取不同純化處理的菌種，每個(gè)接5支試管，25℃恒溫培養(yǎng)，3 d后開始測日平均生長速度，每隔3 d測1次，并觀察其長勢。

由表1可知，高度純化菌種日平均生長速度最快，達(dá)4.88 mm/d；藥物濾菌法次之，為4.62 mm/d，二者與未純化菌種之間差異極顯著。高度純化菌種與藥物濾菌法純化所得菌種之間差異達(dá)顯著水平，并且菌絲生長最旺盛，說明經(jīng)高度純化的菌種活性最強(qiáng)[6]。

2.2 未純化和高度純化菌種對(duì)固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基污染率的影響

未純化和經(jīng)過高度純化的PDA斜面母種分別在接種機(jī)前和超凈工作臺(tái)中接到固體鋸末為主料的原種瓶[7]和用250 mL容量三角瓶盛裝的液體培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接10個(gè)，每支PDA斜面母種分兩部分，1/2接固體培養(yǎng)基，1/2接液體培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)。

從表2可以看出，同樣的斜面菌種接到固體培養(yǎng)基上能夠正常生長，接到液體培養(yǎng)基上卻大比例染菌[8]，而經(jīng)高度純化處理的菌種污染率極低，說明染菌與接種方式無關(guān)。由此可見，對(duì)用于液體菌種生產(chǎn)的普通斜面母種進(jìn)行純化處理是相當(dāng)必要的。

表1 菌絲生長速度多重比較（SSR法）和菌絲長勢

表2 不同純化方式對(duì)培養(yǎng)基的污染結(jié)果

2.3 未純化菌種與高度純化菌種在液體培養(yǎng)基中的表現(xiàn)

2種不同處理的菌種分別接入液體培養(yǎng)基中，28℃靜置24 h，然后在28℃，150 r/min條件下，恒溫振蕩培養(yǎng)4 d。

從表3可以看出，高度純化過的菌種接到液體培養(yǎng)基上比未純化的菌種具有萌發(fā)快、產(chǎn)生的菌球量大、菌球均勻一致而且不易沉淀等特點(diǎn)。

表3 不同純化方式菌種在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，經(jīng)過木屑濾菌法和藥物濾菌法純化的菌種較未純化菌種生長速度快，菌絲生長旺盛。經(jīng)方差分析得出，二者之間差異極顯著。這對(duì)于其他菌種的活化具有借鑒意義。

采用木屑濾菌法和藥物濾菌法純化的菌種，去除了細(xì)菌和霉菌等雜菌的污染[9]，在液體培養(yǎng)時(shí)不僅污染率低，而且萌發(fā)快，產(chǎn)生的菌球量大，菌球均勻一致且不易沉淀，符合液體培養(yǎng)對(duì)菌種的特殊要求。

經(jīng)過藥物濾菌法純化的菌種，活性比未純化菌種有明顯提高，這可能與培養(yǎng)基中的藥物刺激有關(guān)，但是否會(huì)對(duì)菌種的生物學(xué)特性有所改變、在實(shí)際生產(chǎn)栽培中對(duì)產(chǎn)量有無影響，還有待于進(jìn)一步研究。

［1］ 蔡德華，楊立紅，徐海英.食用菌液體菌種制種工藝的研究[J].當(dāng)代生態(tài)農(nóng)業(yè)，2003（Z1）：19-24.

［2］ 高孔榮.發(fā)酵設(shè)備 [M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1991：71-73.

［3］ 汪國蓮，陳立國，陳明.銀耳菌絲體生長營養(yǎng)條件的初步研究[J].中國食用菌，2001，20（4）：12-14.

［4］ 王芳，張玉萍，孟麗君.平菇液體菌種培養(yǎng)條件的研究[J].食用菌，2008（6）：21-22.

［5］ 高芬，穆凌霄，魏穎穎，等.煙草赤星病菌拮抗鏈霉菌的多重篩選及發(fā)酵液理化性質(zhì) [J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（6）：171-175.

［6］ 王世東.食用菌 [M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2005：101-102.

［7］ 吳國定.楊樹木屑栽培毛木耳試驗(yàn)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990（1）：18.

［8］ 林樹錢.中國藥用菌生產(chǎn)與產(chǎn)品開發(fā)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：206-209.

［9］ 高曉華.一級(jí)種的基內(nèi)菌絲提純法[J].食用菌，2010（2）：26.