苦瓜種子蛋白的抗菌實(shí)驗(yàn)

魏 決,羅 雯

(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院,四川成都 610106)

苦瓜種子蛋白的抗菌實(shí)驗(yàn)

魏 決,羅 雯

(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院,四川成都 610106)

采用堿提法提取苦瓜種子中的蛋白質(zhì),抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：苦瓜種子蛋白對大腸桿菌、根霉菌和釀酒酵母菌都有明顯的抑菌作用,而對根霉菌作用最明顯,此表明苦瓜種子有較高的藥用保健價(jià)值.

苦瓜蛋白;大腸桿菌;根霉菌;釀酒酵母菌;抑菌作用

0 引 言

苦瓜為葫蘆科一年生攀援草本苦瓜屬植物的果實(shí),具有瓜類食品特性,是常用蔬菜之一.苦瓜果實(shí)雖性寒味苦,卻富含營養(yǎng)和藥用成分,具有清火明目、解毒、降低血糖等多種功效,常用于中暑、痢疾、赤眼疼痛、癰腫丹毒、惡瘡等癥的治療.目前,國內(nèi)外學(xué)者從苦瓜的果實(shí)和種子中分離出許多水溶性蛋白質(zhì)和萜皂苷等成分,研究表明,其具有降血糖、抗生育、抗腫瘤及免疫抑制活性等作用[1-4].此外,苦瓜汁具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌和治療小兒痢疾等作用.

目前,人們對苦瓜種子的相關(guān)研究不多,而苦瓜種子蛋白含量高,蛋白質(zhì)組分復(fù)雜,有其獨(dú)特的藥理作用[5,6].因此,本文擬通過研究苦瓜種子蛋白對大腸桿菌、釀酒酵母菌和根霉菌的抑制效果,并與化學(xué)合成防腐劑的防腐作用對比,以期對苦瓜種子蛋白作為一種天然的抗菌防腐劑的研究進(jìn)行有益探索.

1 材料、儀器與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)材料.

實(shí)驗(yàn)所用苦瓜籽購于成都市蔬菜種子站.大腸桿菌、釀酒酵母菌和根霉菌由成都大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 試 劑.

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括：硫酸銅,濃硫酸,磷酸氫二鈉,磷酸二氫鉀,氯化鈉,硫酸銨,鹽酸,考馬斯亮藍(lán)試劑,氫氧化鈉,M.H瓊脂,麥芽糖培養(yǎng)基,察氏培養(yǎng)基.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：恒溫水浴鍋,高速離心機(jī),紫外分光光度計(jì),電熱恒溫干燥箱,分析天平,托盤天平,電熱恒溫培養(yǎng)箱,手提式壓力蒸汽滅菌鍋等.

1.3 方 法

1.3.1 苦瓜籽的處理.

選擇大小一致的苦瓜籽,用食品粉碎機(jī)粉碎苦瓜籽殼后,選出殼內(nèi)的苦瓜種子,再用食品粉碎機(jī)將其粉碎成細(xì)粉,將粉碎后的細(xì)粉平鋪風(fēng)干后,置于干燥的地方保存.

1.3.2 配制pH值為8.04的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液.

稱取11.876 g磷酸氫二鈉,9.078 g磷酸二氫鉀分別置于2個(gè)小燒杯中,加入純凈水,待其溶解后分別將其倒入2個(gè)1 000 mL的容量瓶中,將小燒杯清洗幾次,并分別把清洗液倒入容量瓶,分別定容至1 000 mL,容量瓶搖勻.取95 mL磷酸氫二鈉溶液和5 mL磷酸二氫鉀溶液倒入小燒杯中并搖勻,配制成pH值為8.04的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液. 1.3.3 磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液提取苦瓜種子中的蛋白質(zhì).

稱取10 g苦瓜種子細(xì)粉于磨口三角瓶中,取配制好的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液100 mL倒入磨口三角瓶中,搖勻后放入4℃的冰箱中提取12 h.

將磨口三角瓶從冰箱中取出,立即用真空循環(huán)泵抽濾,取上清液,將抽濾后的液體裝入小燒杯中,記錄液體的體積,同時(shí),上清液加入飽和度硫酸銨, 4℃環(huán)境下攪拌沉淀3 h后,取上面的蛋白質(zhì)溶液,棄去下面的沉淀.在常溫下將溶液在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心20 min后取出,去除上清液,將蛋白質(zhì)用藥匙刮出后放入另一個(gè)小燒杯,并加少量純凈水使其溶解.

1.3.4 苦瓜種子蛋白定性試驗(yàn).

苦瓜種子蛋白的定性實(shí)驗(yàn)采用雙縮脲法.取一支試管加入1 mL苦瓜種子蛋白液,再加入5滴10%的NaOH溶液,搖勻后,繼續(xù)加入1滴1%的CuSO4溶液,若出現(xiàn)紫紅色現(xiàn)象則表明有蛋白質(zhì)存在.

1.3.5 苦瓜種子蛋白含量測定.

苦瓜種子的蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定.

1.3.6 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中,加入100 mL 85%磷酸,用蒸餾水稀釋至1 000 mL,濾紙過濾.

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：結(jié)晶牛血清蛋白,預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據(jù)其純度用0.15 mol/L Nacl配制成1 mg/mL,0.1 mg/mL的蛋白溶液.

在分光光度計(jì)上于波長595 nm處繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.7 樣品的定量.

實(shí)驗(yàn)采用以上同樣的操作方法對提取的蛋白質(zhì)樣品稀釋50倍后進(jìn)行定量.

1.3.8 培養(yǎng)基的制備.

培養(yǎng)基的制備包括：

(1)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g,蛋白胨1 g,Nacl 0.5 g,蒸餾水1 000 mL,pH值為7.2.將培養(yǎng)基分裝入250 mL錐形瓶中,每個(gè)錐形瓶裝25 mL,用紗布加橡皮筋包扎.

(2)麥芽糖液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g,麥芽糖20 g,酵母酶淀粉5 g,蒸餾水1 000 mL,自然pH值.操作方法方法同上.

(3)察氏液體培養(yǎng)基：蔗糖 3 g,NaNO30.3 g, K2HPO40.1 g,KCl 0.05 g,MgSO47H2O 0.05 g,EDTA少量,蒸餾水1 000 mL,自然pH值.操作方法同上.

(4)菌層培養(yǎng)基的配制同液體培養(yǎng)基配制的方法相同,在定容之后加入0.7%的瓊脂,電爐上加熱充分溶化后,加棉塞.

(5)底層培養(yǎng)基的配制同液體培養(yǎng)基配制,并加入少量的C源、N源等營養(yǎng)物質(zhì),在定容之后加入1.5%的瓊脂,在電爐上加熱充分溶化后,加棉塞.

(6)滅菌處理.將以上液體培養(yǎng)基、菌層培養(yǎng)基、底層培養(yǎng)基和接種所需的器皿,經(jīng)包扎后放入滅菌鍋滅菌.

(7)菌液的制備：①菌種活化.在接種室內(nèi),用接種環(huán)挑起一小環(huán)放入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中,將液體培養(yǎng)基瓶口滅菌塞好.28℃震蕩培養(yǎng),根據(jù)菌種的不同培養(yǎng)時(shí)間不同,大腸桿菌6～7 h,釀酒酵母菌和根霉菌72 h.②菌液培養(yǎng)基的制備.將菌層培養(yǎng)基溶化到50℃,然后將經(jīng)活化后的菌倒入其中,震蕩均勻.

1.4 抑菌試驗(yàn)

1.4.1 抗生素溶液的制備.

取阿莫西林膠囊5個(gè),將其中的粉末倒出用蒸餾水溶解,放置一段時(shí)間,去除沉淀取上清液.然后于接種室中,將底層培養(yǎng)基溶化,15 mL分別倒入9個(gè)平板,待凝固,將每個(gè)菌種的菌層培養(yǎng)基5 mL分別倒入3個(gè)凝固的底層培養(yǎng)基上,均勻涂布,即每個(gè)菌種做3組平行實(shí)驗(yàn),凝固后將滅菌的牛津杯放置在培養(yǎng)基上,每個(gè)平板放4個(gè),使其與培養(yǎng)基接觸無間隙,并在培養(yǎng)皿背后做上編號,然后分別在每個(gè)牛津杯中加滿0.5 IU/mL抗生素、無菌水,0.2%山梨酸鉀和4.6 mg/mL苦瓜籽蛋白液進(jìn)行培養(yǎng),其中大腸桿菌37℃、24 h,釀酒酵母菌30℃、48 h,根霉菌30℃、72 h,12 h后開始觀察.最后分別測定抑菌圈直徑(取平均值),并比較苦瓜種子蛋白液對各試驗(yàn)菌的抑菌效果.

1.4.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定.

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可知苦瓜種子蛋白提取液的濃度,將提取液進(jìn)行稀釋,得濃度分別為4.6 mg/mL, 3.8 mg/mL,3.0 mg/mL,2.2 mg/mL,1.4 mg/mL, 0.6 mg/mL的溶液,每一系列濃度接種一種菌,同樣用牛津杯法將它們加入各菌層培養(yǎng)基孔隙內(nèi),每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù),按以上抑菌試驗(yàn)的步驟方法,置適宜溫度下培養(yǎng),觀察生長情況.培養(yǎng)基中完全沒有菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 苦瓜種子蛋白定性試驗(yàn)

苦瓜種子蛋白的定性試驗(yàn)采用雙縮脲試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)試管溶液有紫紅色現(xiàn)象出現(xiàn),說明提取出來的物質(zhì)為蛋白質(zhì).

2.2 苦瓜種子蛋白定量試驗(yàn)

將苦瓜種子提取液稀釋50倍,測得樣品稀釋液OD值為0.614,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)得到苦瓜種子蛋白原液的濃度為4.6 mg/mL,實(shí)驗(yàn)中,苦瓜種子蛋白的得率為3.2 mg/g.

圖1 考馬斯亮藍(lán)G-250測定牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 苦瓜種子蛋白抑菌效果

苦瓜種子蛋白抑菌效果如表1所示.表1數(shù)據(jù)表明,苦瓜種子蛋白對大腸桿菌、根霉菌和釀酒酵母菌均有明顯的抑制作用,說明在苦瓜種子蛋白中有對細(xì)菌和霉菌有抑制作用的蛋白成分存在.同時(shí),由表1數(shù)據(jù)可知,其對霉菌和酵母菌的抑制效果較強(qiáng),細(xì)菌次之.

表1 苦瓜種子蛋白抑菌效果

2.4 苦瓜種子蛋白最低抑菌濃度(MIC)

苦瓜種子蛋白液的最低抑菌濃度范圍在3.0～3.8 mg/mL(見表2),且對真菌的抑菌濃度較低,說明苦瓜籽蛋白對真菌的抑制效果較好.

表2 苦瓜種子蛋白濃度對供試菌種抑菌效力的影響

3 討 論

通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),苦瓜種子蛋白對細(xì)菌和真菌都有明顯的抑菌作用,其中對真菌的抑制效果好于細(xì)菌.

苦瓜種子蛋白對3種實(shí)驗(yàn)菌最低抑菌濃度分別為：根霉菌3.0 mg/m L,釀酒酵母菌為3.0 mg/m L,大腸桿菌為3.8 mg/m L.這也顯示苦瓜種子蛋白對根霉和釀酒酵母菌的抑制作用相對較強(qiáng),而對細(xì)菌的抑制作用相對較弱.

目前,人們已從多種植物中發(fā)現(xiàn)了抗菌蛋白和抗菌肽成分[7,8],從苦瓜種子蛋白的抑菌作用可知其中含有抑制微生物生長的組分,這可作為天然食品防腐劑和抗菌消炎藥物成分加以開發(fā).關(guān)于苦瓜種子蛋白中具體的抑菌成分及抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究.

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[3]龔大春,楊雪海.苦瓜種子蛋白抑菌作用探討[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志,2005,49(6)：8-9.

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Antimicrobial Experiment of Protein Contained in Balsam Pear Seed

WEI Jue,LUO Wen

(School of Bioindustry,Chengdu University,Chengdu 610106,China)

Alkali formulation was used to extract the protein contained in balsam pear seeds for doing antimicrobial experiment.The findings show that the protein contained in balsam pear seeds has a significant antimicrobial effect on E.coli,Rhizopus and Saccharomyces cerevisiae.The most obvious effect is on root fungus,which indicates the seeds have high medicinal value of health care.

balsam pear;escherichia coli;rhizopus;saccharomyces cerevisiae;antibacterial effect

S642.5;R282.71

：A

1004-5422(2010)02-0098-03

2009-12-18.

魏 決(1962—),女,副教授,從事食品加工工藝及天然有效成分提取研究.