耐酸乳酸菌的篩選及初步鑒定

茍興華,王艷文,李 翔,劉達(dá)玉,王 衛(wèi)

(1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院,四川成都 610106;2.肉類加工四川省重點實驗室,四川成都 610106)

耐酸乳酸菌的篩選及初步鑒定

茍興華1,2,王艷文1,李 翔1,2,劉達(dá)玉1,2,王 衛(wèi)2

(1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院,四川成都 610106;2.肉類加工四川省重點實驗室,四川成都 610106)

以自然發(fā)酵泡菜汁液為菌源,以不同的pH值作為對照,并利用不同的pH值作為篩選的初步條件,對耐酸乳酸菌進(jìn)行篩選,然后對篩選出的菌株做定性實驗,包括：產(chǎn)生溶鈣圈,革蘭氏染色陽性,以及接觸酶反應(yīng)呈陰性.在本實驗條件下初步篩選出耐酸性強(qiáng)的2株菌株：菌株2,菌株3,同時,對分離出的乳酸菌菌株劃線于MRS固體斜面培養(yǎng)基上,于4℃下保存,為進(jìn)一步研究奠定了良好的基礎(chǔ).

耐酸乳酸菌;篩選;初步鑒定

0 引 言

凡能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸菌的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌.大量的科研結(jié)果表明,以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌,其數(shù)量的多少,直接影響到人們的健康及壽命長短[1].研究表明,大部分乳酸菌在通過人體消化道到達(dá)腸道之前,因不能耐受胃液酸度而死亡,而僅有少數(shù)乳酸菌能耐酸,此類耐酸性乳酸菌能在人體中更有效地發(fā)揮保健作用,因此具有很大的開發(fā)價值[2,3].

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)是人類和動物腸道內(nèi)有益微生物之一,其可以阻止病原微生物對腸道的入侵和定植,抑制病原菌和抗感染,維持腸道的微生態(tài)平衡,預(yù)防和抑制腫瘤的發(fā)生,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,促進(jìn)消化,降低膽固醇,抑制內(nèi)毒素的發(fā)生,延緩機(jī)體衰老和抗輻射等.嗜酸乳酸菌在腸道中的數(shù)量與宿主的健康狀況有著密切的關(guān)系,這已引起了人們的特別關(guān)注.嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物細(xì)菌素,不僅可以改善腸道的微生態(tài),而且是一類具有潛在開發(fā)價值的天然食品防腐劑和飼料添加劑.目前,耐酸乳酸菌已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥以及工業(yè)等領(lǐng)域.本研究的主要目的是初步篩選出可以預(yù)期作為調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的微生態(tài)制劑菌株,為今后的應(yīng)用及研究打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 菌株來源.

以自然發(fā)酵泡菜作為篩選菌株的主要來源.

1.1.2 培養(yǎng)基.

MRS選擇培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g、牛肉提取物10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、無水乙酸鈉5 g、吐溫-80 1 mL、檸檬酸二胺2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g(固體培養(yǎng)基中加瓊脂約15 g、3%碳酸鈣)、蒸餾水1 000 m L,pH值為6.2～6.8.

1.1.3 試 劑.

實驗所用試劑包括：正丁醇,甲酸,乙酸,乳酸, 3%溴甲酚藍(lán)酒精溶液,3%過氧化氫等,均為分析純.

1.1.4 儀 器.

實驗所用儀器包括：手提式不銹鋼蒸汽消毒器, LRH系列生化培養(yǎng)箱,無菌操作臺,FA(N)/JA(N)系列電子天平.

1.2 實驗方法

1.2.1 耐酸乳酸菌的初步分離.

取自然發(fā)酵泡菜汁液1 mL以10倍遞增稀釋方法(1份泡菜汁,9份無菌水,再取1份第1支管中溶液,加9份無菌水,依次類推)將其稀釋,然后分別取第4～6支試管稀釋液1 mL,傾注于pH值為3.5和pH為3.0的MRS液體培養(yǎng)基上,放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h.

1.2.2 耐酸乳酸菌初步分離后的純化.

用接種環(huán)以無菌操作方式挑取自然發(fā)酵泡菜稀釋液,將挑取有樣品的接種環(huán)在MRS固體培養(yǎng)基上做連續(xù)劃線,劃線完畢后,蓋上培養(yǎng)皿蓋,倒置于溫室中培養(yǎng).

1.2.3 耐酸乳酸菌的進(jìn)一步分離.

分別取第4～6支試管稀釋液1 mL,傾注于pH值為3.3的MRS液體培養(yǎng)基上,放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48 h.

1.2.4 耐酸乳酸菌的進(jìn)一步純化.

耐酸乳酸菌的進(jìn)一步純化步驟按1.2.2項下步驟進(jìn)行.

1.2.5 細(xì)胞染色及形態(tài)鑒定.

在菌落形態(tài)方面,觀察分離培養(yǎng)基平板上菌落的形態(tài)(形狀、色澤、大小等);在細(xì)胞形態(tài)方面,將所分離的菌株進(jìn)行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌體形態(tài).

1.2.6 過氧化氫酶(接觸酶)反應(yīng).

將3%的過氧化氫滴于涂有菌苔的載玻片上,靜置1～3 min,觀察是否有氣泡產(chǎn)生.

1.2.7 產(chǎn)乳酸定性分析實驗.

本實驗采用乳酸紙層析法做產(chǎn)乳酸定性分析,具體方法如下：

(1)層析濾紙的制備.將層析濾紙剪成1.5 cm× 11 cm的長條狀,在距層析紙一端約4 cm處用鉛筆劃線確定點樣線,使用前充分干燥.

(2)配制展開劑.正丁醇∶甲酸∶水為80∶15∶5. (3)配制標(biāo)準(zhǔn)液.配制1.5%的乳酸溶液.

(4)制備待測樣品.將菌種37℃培養(yǎng)24 h后離心,收集上清液

(5)點樣.用毛細(xì)管分別吸取發(fā)酵液,多次點樣于濾紙條上,樣點直徑不宜超過2 mm,平衡2 h.

(6)層析.將點好樣的層析紙放入,使點有樣品的一端浸在展開劑中,但不可浸及樣點.觀察展開情況,待展開劑前沿到達(dá)離層析紙另一端約1.5 cm處,取出層析紙.

(7)顯色.以3%溴甲酚藍(lán)酒精溶液為顯色劑,待層析液揮發(fā)之后,向?qū)游鰹V紙噴灑并計算 Rf值.

1.2.8 菌種保存.

目標(biāo)菌株純化后,劃線于MRS固體斜面培養(yǎng)基上,于4℃下保存.

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸乳酸菌初步分離純化后結(jié)果

耐酸乳酸菌在pH值分別為3.5與3.0的液體MRS液體培養(yǎng)基上經(jīng)初步分離后,在MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化.在pH值為3.5的液體培養(yǎng)基中生長的菌株接種到固體培養(yǎng)基上時,形成溶鈣圈的菌落眾多,排列緊密,且長勢良好;在pH值為3.0的液體培養(yǎng)基上生長的菌株接種到固體培養(yǎng)基上時,無明顯菌落形成,更無產(chǎn)生溶鈣圈的菌落產(chǎn)生.

2.2 耐酸乳酸菌進(jìn)一步分離純化后結(jié)果

在pH值為3.3的MRS液體培養(yǎng)基上分離的菌株接種到固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后,在固體培養(yǎng)基上形成的溶鈣圈明顯,約1～3 mm,圓形隆起,表面光滑或稍粗糙,呈乳白色、灰白色或暗黃色,形態(tài)良好的菌落若干個.即在介于pH值為3.5和3.0之間pH值為3.3的條件下,分離得到了相對耐酸性較強(qiáng)的菌株.

2.3 細(xì)胞染色與形態(tài)鑒定結(jié)果

隨機(jī)挑取3個菌落的細(xì)胞進(jìn)行染色和形態(tài)鑒定：3個菌落的細(xì)胞均呈多樣形桿狀(長或細(xì)長桿狀,彎曲形短桿狀及棒形球桿狀),呈鏈狀排列.同時,革蘭氏染色呈陽性.

2.4 過氧化氫(接觸酶)反應(yīng)實驗結(jié)果

將3%的過氧化氫滴于涂有菌苔的載玻片上,靜置1～3 min,菌落1有氣泡產(chǎn)生,菌落2和3無氣泡產(chǎn)生.

接觸酶又稱為過氧化氫酶,是一種以正鐵血紅素作為輔基的酶,能將過氧化氫分解為水和氧.一般好氧細(xì)菌與兼性厭氧細(xì)菌(除某些鏈球菌、乳酸桿菌等外)都能產(chǎn)生接觸酶,而厭氧細(xì)菌不產(chǎn)生接觸酶,不發(fā)生過氧化氫反應(yīng).本實驗結(jié)果表明：菌落1的細(xì)菌為好氧細(xì)菌或是兼性厭氧細(xì)菌;而菌落2和3的細(xì)菌為厭氧細(xì)菌.

2.5 產(chǎn)乳酸定性分析實驗結(jié)果

采用紙層析法測試乳酸噴顯色劑后顯色情況,實驗結(jié)果如圖1所示.

Rf1=19/25=0.76,Rf2=18.8/25=0.752,Rf3=18.9/25=0.756圖1 產(chǎn)乳酸定性分析結(jié)果

結(jié)果分析顯示：噴顯色劑后菌落2和3都出現(xiàn)黃色斑點,與2%乳酸對照相比,位置基本相同,證明有乳酸的存在,表明2種菌都產(chǎn)乳酸.

3 結(jié) 論

本文以自然發(fā)酵泡菜汁液為菌源,以pH值作為對照,首先利用不同的pH值作為篩選的初步條件,進(jìn)行了耐酸乳酸菌的篩選,然后對篩選出的菌株做定性實驗,包括產(chǎn)生溶鈣圈,革蘭氏染色陽性,以及接觸酶反應(yīng)呈陰性,從而初步篩選出在本實驗條件下耐酸性強(qiáng)的2株菌株：菌株2,菌株3,分離出的乳酸菌菌株已經(jīng)劃線于MRS固體斜面培養(yǎng)基上,于4℃下保存.

在下一步的研究中,我們擬進(jìn)一步進(jìn)行乳酸菌的定性分析實驗,同時對其16s RNA進(jìn)行測序分析.需要說明的是,如何在發(fā)酵以及其他領(lǐng)域應(yīng)用好這些菌株來強(qiáng)化發(fā)酵食品以及其他制品的保健功能性,提高農(nóng)副產(chǎn)品的附加值是今后科研工作的重點和難點.

[1]張大為,張 潔,丁成華.嬰兒腸道內(nèi)嗜酸乳桿菌L2的篩

選及菌株代謝產(chǎn)物的初步分析[J].食品科學(xué),2008,29 (4)：221-226.

[2]馬德功,王成忠,崔文文,等.發(fā)酵香腸乳酸菌發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)[J].肉類研究,2007,21(12)：36-38.

[3]陳 霞,烏日娜,孟 和,等.乳酸菌耐酸機(jī)理[J].中國乳品工業(yè),2008,36(3)：31-35.

[4]管立軍,李艷芳,程永強(qiáng),等.產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及分離鑒定[J].食品科技,2009,34(1)：10-13.

[5]王玉華,張桂榮,劉景圣.2株耐酸及耐膽鹽嗜酸乳桿菌的分離篩選及其發(fā)酵特性研究[J].東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,38(3)：121-124.

[6]潘繼紅,呂正兵,夏 穎,等.酸乳中乳酸細(xì)菌的分離及酸乳制作工藝的探討[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2000,23(1)：69-70.

[7]李海燕,徐 杰,云月英,等.傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中瑞士乳桿菌耐酸性的篩選[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2006,29(4)：9-11.

[8]胡書芳,王雁萍.乳酸菌在泡菜生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(21)：275-277.

[9]陳 濤,曹 毅,伊芬芬,等.一株耐酸硫酸鹽還原菌的分離篩選及生理特性研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,43(2)：215-221.

[10]徐海燕,曹 斌,楊軍方.雞源嗜酸乳桿菌的篩選[J].中國飼料,2006,17(19)：35-37.

[11]陳 欣,潘素華,胡黎黎,等.人源乳酸桿菌耐酸耐膽鹽能力的測定和鑒定[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,33(3)：28-29.

Preliminary Identification and Screening of Acid-resisting Lactic Acid Bacteria

GOU Xinghua1,2,WANG Yanwen1,LI Xiang1,2,LIU Dayu1,2,WANG Wei2

(1.School of Bioindustry,Chengdu University,Chengdu 610106,China; 2.Key Meat Processing Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610106,China)

Taking the natural fermentation of kimchi as germ origin,different PH values as comparing aspects as well as preliminary screening conditions,acid-resisting lactic acid bacteria was screened and the screened strains were used to do qualitative experiments,which consisted of generating circle of calcium dissolved,the results of Gram stain test and catalyzing reaction were positive and negative respectively.Finally,two acid-proof strains,namely Strain 2 and Strain 3 were obtained in this experiment.In order to do the following study,the two kinds of lactic acid bacteria have been crossed on MRS solid slope medium and preserved at the temperature of 4℃.

acid-proof lactic acid bacteria;screen;preliminary identification

Q935

：A

1004-5422(2010)02-0095-03

2009-12-15.

茍興華(1963—),男,博士,副教授,從事食品生物技術(shù)研究.

文章編號：1004-5422(2010)02-0120-04