動態(tài)觀察姜黃素對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠尿液AD7C－NTP濃度的影響

李瑞晟，李勇，王虹，任映，朱志慧，孫海蕓，楊金鐸，王蓬文

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥藥理學(xué)實驗室，北京 100700)

動態(tài)觀察姜黃素對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠尿液AD7C－NTP濃度的影響

李瑞晟，李勇，王虹，任映，朱志慧，孫海蕓，楊金鐸，王蓬文

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥藥理學(xué)實驗室，北京 100700)

目的 通過動態(tài)檢測小鼠尿液中AD7C－NTP的濃度變化，了解姜黃素在阿爾茨海默病治療方面的作用。方法 3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠35只，隨機分為5組，每組7只，分別為模型組，陽性對照組(羅格列酮組)，姜黃素大、中、小劑量組;另選用同月齡同背景的C57BL/6J小鼠7只作為正常對照組。以上6組連續(xù)灌胃3個月，分別于灌胃前、灌胃30 d、灌胃60 d和灌胃90 d收集小鼠尿液，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測尿AD7C－NTP濃度的變化。結(jié)果 不同時間點各組小鼠尿AD7C－NTP濃度的動態(tài)存在波動，各治療組治療2個月與治療1個月相比，AD7C－NTP濃度均有所下降(P＜0.05，P＜0.01);同一時間點小鼠尿 AD7C－NTP濃度組間比較:治療2個月后，西藥組，姜黃素大、小劑量組與模型組相比AD7C－NTP濃度有所下降(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)論姜黃素可降低AD模型小鼠尿液內(nèi)AD7C－NTP濃度，延緩AD的進(jìn)展。

姜黃素;APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠;AD7C－NTP;阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以隱匿起病和進(jìn)行性認(rèn)知功能損害為特征的神經(jīng)變性病，目前西醫(yī)用于AD治療的主要藥物多限于對癥治療，而對AD的病理進(jìn)程影響較小，并且較大的毒副作用限制了其廣泛應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外臨床和實驗研究表明，中藥單體姜黃素(curcumin)具有廣泛的藥理作用，部分研究結(jié)果表明其在改善AD認(rèn)知功能，減輕炎性反應(yīng)及抗氧化損傷等方面都具有良好效果［1］。盡管已證實姜黃素具有多種功效，但其藥物作用機制卻始終沒有定論。在一項篩查疑似AD患者的臨床試驗中，阿爾茨海默相關(guān)的神經(jīng)絲蛋白(Alzheimer－associated neuronal thread protein，AD7c－NTP)含量檢測被認(rèn)為是確診 AD的有效指標(biāo)，符合率達(dá)91.4%［2］。另有文獻(xiàn)報道噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物羅格列酮，能夠改善AD的認(rèn)知功能［3］，同時也有結(jié)果顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元富含的胰島素受體和胰島素樣生長因子1極易被AD7C－NTP 損傷［4］?；谏鲜鲇^點，我們采用羅格列酮作為陽性對照組并選取AD7c－NTP作為研究指標(biāo)，從 AD模型 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的尿液AD7c－NTP濃度動態(tài)變化出發(fā)，動態(tài)觀察不同時間、不同劑量姜黃素對AD的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠及同月齡同背景的 C57BL/6J正常小鼠，體質(zhì)量22～25 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所［SCXK(京)2009－0004］。小鼠飼養(yǎng)和實驗均在屏障環(huán)境動物實驗室內(nèi)進(jìn)行【SYXK(京)2004－2009】。小鼠飼料為清潔級維持鼠料，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司供給【SCXK(京)2005－0007】。小鼠墊料為消毒墊料，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供。飲用水為消毒水。

1.2 藥物與試劑

姜黃素為美國 Sigma－Aldrich公司產(chǎn)品，批號為c1386;馬來酸羅格列酮片為葛蘭素史克(天津)有限公司產(chǎn)品，批號為09060108;羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose，CMC)為北京精求化工有限責(zé)任公司，批號為3405005;用前配制成 0.5%4℃冰箱儲存;AD7C－NTP檢測試劑盒來自深圳市安群生物工程有限公司，批號為20091115。

1.3 儀器

CB－128C酶標(biāo)儀(中國香港);賽多利斯電子天平 BS124S(德國)。

1.4 灌胃藥物配制

1.4.1 姜黃素大、中、小劑量:用精密天平稱取姜黃素 2.40、1.20和 0.60 g，分別溶于 60 mL 0.5%CMC中，搖勻后置100 mL棕色瓶中4℃冰箱儲存，配好后的溶液濃度分別為40、20、10 mg/mL。

1.4.2 陽性對照組(羅格列酮組):取羅格列酮(每片含原藥4 mg)15片，碾成粉末后溶于60 mL 0.5%CMC中，搖勻后置100 mL棕色瓶中4℃冰箱儲存，配好后的溶液濃度為1 mg/mL;正常對照組及模型組:60 mL 0.5%CMC，置100 mL棕色瓶中4℃冰箱儲存。以上灌胃藥物每15d配制1次，共需配制6次。

1.5 分組與給藥

3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠35只，隨機分為5組，每組7只。①陽性對照組:羅格列酮10 mg/(kg·d)灌胃;②姜黃素大劑量組:姜黃素400 mg/(kg·d)灌胃;③姜黃素中劑量組:姜黃素200 mg/(kg·d)灌胃;④姜黃素小劑量組:姜黃素100 mg/(kg·d)灌胃;⑤模型組:等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃;⑥另設(shè)正常對照組:采用與 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠同月齡同背景的 C57BL/6J正常小鼠7只，等體積0.5%CMC灌胃。

1.6 尿液收集

所有實驗動物均連續(xù)灌胃3個月，并分別于灌胃前、灌胃30 d、灌胃60 d和灌胃90 d四個時間點，采用代謝籠收集小鼠尿液。尿液收集在1.5 mL EP管中，4℃冰箱儲存，在48 h內(nèi)檢測。

1.7 AD7C-NTP檢測

采用AD7C－NTP檢測試劑盒對小鼠尿液進(jìn)行測定，具體步驟為:①將所需的微孔條固定于板架上，編好順序;②在相應(yīng)孔中分別加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品和尿樣(標(biāo)準(zhǔn)品做雙孔)，空白孔不加;③用封口膜將條板封好(防止污染)，置37℃溫浴60 min;④取出板條，甩干，在吸水紙上輕拍數(shù)下，每孔加入配制好的洗滌液200 ～300 μL，停留20 ～30 s，甩干，在吸水紙上輕拍數(shù)下，反復(fù)洗滌5次，在洗滌過程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡;⑤每孔加入 AD7C－NTP多抗 100 μL，空白孔不加;⑥用封口膜或塑料膠條將板封好，置37℃溫浴30 min;⑦反應(yīng)后，再次洗滌(同4)，拍干;⑧每孔加入酶聯(lián)物100 μL，空白孔不加;⑨用封口膜或塑料膠條將板封好，置37℃溫浴30 min;⑩反應(yīng)后，再次洗滌(同4)，拍干;○11每孔加入顯色劑 A和顯色劑B各50 μL或一滴，必須保證同一速度加入顯色劑，中間不應(yīng)有間斷;○12于37℃避光顯色15 min后，盡快加入50 μL或一滴終止液于各孔中;○13在酶標(biāo)儀上選定450 nm波長，以空白孔調(diào)零，測定每組的吸光度值;○14根據(jù)所測得吸光度值計算相應(yīng)的濃度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量數(shù)據(jù)以(±s)表示，各組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點各組小鼠尿AD7C-NTP濃度的動態(tài)比較

治療1個月后，各組小鼠尿 AD7C－NTP濃度升高，除模型組外，其余各組均與治療前相比無統(tǒng)計學(xué)差異;治療2個月與治療1個月相比，陽性對照組(羅格列酮組)、姜黃素大、中、小劑量組均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05，P＜0.01)。治療3個月與治療2個月相比，陽性對照組(羅格列酮組)及姜黃素大、中劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，小劑量組無差別，結(jié)果見表1(單位:ng/mL)。

表1 不同時間點各組小鼠尿AD7C－NTP濃度的動態(tài)比較(n=7，±s)Tab.1 Dynamic comparison of mice AD7C－NTP concentration in each group of mice

表1 不同時間點各組小鼠尿AD7C－NTP濃度的動態(tài)比較(n=7，±s)Tab.1 Dynamic comparison of mice AD7C－NTP concentration in each group of mice

注:與治療前比較*P＜0.05**P＜0.01;與治療1個月比較◆P＜0.05◆◆P＜0.01;與治療2個月比較★P＜0.05★★P＜0.01。Note:Comparison with that before treatment*P＜0.05**P＜0.01;Comparison with that at 1 month◆P＜0.05◆◆P＜0.01;Comparison with that at 2 months★P＜0.05★★P＜0.01.

治療3個月3 months組別Group治療前Before treatment治療1個月1 month治療2個月2 months正常對照組(Normal control) 1.359±0.171 1.511±0.132 1.367±0.115 0.754±0.453 0.210陽性對照組(Positive control group) 1.579±0.319 1.671±0.183 1.358±0.056◆ 0.794±0.180★★姜黃素大劑量組(High dose curcumin) 1.578±0.227 1.876±0.277 1.353±0.196◆ 0.764±0.212★★姜黃素中劑量組(Medium dose curcumin) 1.695±0.184 1.832±0.232 1.481±0.171◆ 0.853±0.179★★姜黃素小劑量組(Low dose curcumin) 1.646±0.147 1.837±0.352 1.342±0.145**◆◆ 1.048±0.281模型組(Model) 1.496±0.100 1.919±0.702 1.409±0.156 1.180±

2.2 同一時間點小鼠尿AD7C-NTP濃度組間比較

2.2.1 治療前:陽性對照組(羅格列酮組)，姜黃素大、中、小劑量組與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。陽性對照組(羅格列酮組)，姜黃素中、小劑量組與正常對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05，P＜0.01)。

2.2.2 治療1個月后:各組小鼠尿AD7C－NTP濃度升高，但陽性對照組(羅格列酮組)，姜黃素大、中、小劑量組與模型組，正常對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2.3 治療2個月后:西藥組、姜黃素大、小劑量組與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05，P＜0.01)。治療3個月后，正常對照組、陽性對照組(羅格列酮組)、姜黃素大、中劑量組與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05，P＜0.01)，陽性對照組(羅格列酮組)與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，姜黃素小劑量組與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，結(jié)果見表2(單位:ng/mL)。

表2 同一時間點小鼠尿AD7C－NTP濃度組間比較(n=7，±s)Tab.2 Comparison of AD7C－NTP concentration at the same time point among different groups

表2 同一時間點小鼠尿AD7C－NTP濃度組間比較(n=7，±s)Tab.2 Comparison of AD7C－NTP concentration at the same time point among different groups

注:與正常對照組比較ΔP＜0.05ΔΔP＜0.01;與模型組比較 ▲P＜0.05▲▲P＜0.01;與西藥組比較◇P＜0.05◇◇P＜0.01。Note:Comparison with the normal controlΔP＜0.05，ΔΔP ＜0.01;Comparison with the model group▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;Comparison with the western medicine－treated group◇P ＜0.05，◇◇P ＜0.01。

治療3個月3 months正常對照組 Normal control 1.359±0.171 1.511±0.132 1.367±0.115▲ 0.754±0.210組別Group治療前Before treatment治療1個月1 month治療2個月2 months▲▲陽性對照組(Positive control group) 1.579±0.319Δ 1.671±0.183 1.358±0.056▲ 0.794±0.180▲姜黃素大劑量組(High dose curcumin) 1.578±0.227 1.876±0.277 1.353±0.196▲ 0.764±0.212▲▲姜黃素中劑量組(Medium dose curcumin) 1.695±0.184ΔΔ 1.832±0.232 1.481±0.171 0.853±0.179▲姜黃素小劑量組(Low dose curcumin) 1.646±0.147Δ 1.837±0.352 1.342±0.145▲▲ 1.048±0.281Δ模型組(Model) 1.496±0.100 1.919±0.702Δ 1.409±0.156Δ 1.180±0.453ΔΔ◇

3 討論

對于AD的研究，主要集中在以下三個方面，即發(fā)病機制、早期診斷和藥物治療。AD的機制復(fù)雜且不明確，存在許多不同假說，近年來有研究顯示，受損的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是介導(dǎo)AD發(fā)病的共同通路［5］。本實驗研究也發(fā)現(xiàn)，采用小鼠尿AD7C－NTP作為觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)陽性治療組(羅格列酮)與姜黃素治療各組在降低AD7C－NTP濃度方面沒有差異(P＞0.05)，而姜黃素是否也是通過改善受損胰島素通路發(fā)揮作用還有待后續(xù)研究探索。

對于AD的早期診斷，目前還缺乏簡便、高效及廉價的檢測指標(biāo)以及合適的篩查人群，因此如何對早期AD患者進(jìn)行簡便有效的篩查也是AD研究的重點。為此本實驗選取 AD7C－NTP作為早期診斷AD的實驗指標(biāo)，以雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象。

AD7c－NTP屬神經(jīng)絲蛋白家族，在早期AD患者的腦組織、腦脊液和尿液中就有升高，并且其含量與癡呆的嚴(yán)重程度呈正比，是對AD敏感性及特異性均較高的蛋白指標(biāo)［6］，尤其是尿液檢測，實驗標(biāo)本易于獲得，檢測效果較好。而作為模型動物的APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠，表達(dá)突變?nèi)?β－淀粉樣前體蛋白基因 swe(β－amyloid precursor protein，APPswe)和突變早老蛋白 1－A246基因 (presenilin 1，PS 1－246E)，可在短 期 內(nèi) 大 量 產(chǎn) 生 Aβ1－42 及ADDLs，出現(xiàn)擬AD的病理改變，隨年齡的增加這些病理改變會逐漸加重［7］，是公認(rèn)的研究 AD的防治策略的轉(zhuǎn)基因動物模型。

對于中晚期AD的治療，西藥毒副作用較大，長期用藥療效欠佳。而對于早期 AD，由于診斷的滯后性，往往錯過了最佳的藥物治療時間。因此開發(fā)具有能夠早期干預(yù)AD的藥物是目前臨床亟待解決的難題。中藥單體姜黃素是從姜黃屬中藥姜黃、郁金、莪術(shù)等的根莖中提取出來的酚類色素［8］，體外研究顯示姜黃素具有抗Aβ聚集的作用，可抑制Aβ聚集，使已聚集的 Aβ解聚，防止 Aβ42寡聚體的形成和毒性［9，10］。另外姜黃素可減少 Aβ誘導(dǎo)的抗氧化酶水平升高，DNA損傷，tau蛋白過磷酸化和炎癥反應(yīng)［11］;體內(nèi)研究顯示口服姜黃素可抑制Tg2576AD模型小鼠腦內(nèi)炎癥和氧化反應(yīng)，抑制Aβ寡聚體形成和Aβ沉積，降低磷酸化tau和磷酸化胰島素受體底物(IRS－1)水平，改善 Y迷宮的行為學(xué)缺陷［12］。本實驗中我們也觀察到，隨著治療時間的增加，中藥單體姜黃素能夠顯著降低AD模型小鼠尿中AD7C－NTP的含量，表明姜黃素可影響 AD模型動物的疾病進(jìn)展。另外在實驗中還存在一些現(xiàn)象，如在灌胃治療1個月后，各組小鼠的尿 AD7CNTP濃度均有不同程度的升高，這可能是由于AD模型動物疾病進(jìn)展較快，治療還沒有完全發(fā)揮作用所致。值得注意的是，實驗中模型組小鼠尿AD7CNTP濃度在灌胃第3個月時出現(xiàn)下降，但與治療前、治療1個月及治療2個月相比無差異(P＞0.05)，且與同一時間點各治療組相比濃度仍較高，推測尿液中AD7C－NTP的濃度可能在AD疾病發(fā)展過程中存在波動。而出現(xiàn)上述情況的具體原因還有待進(jìn)一步延長實驗時間來證實。

［1］ 李勇，王蓬文.姜黃素神經(jīng)保護(hù)作用研究概況［J］.中國中藥雜志，2009，34(24):3173－3175.

［2］ Goodman I，Golden G，F(xiàn)litman S，et al.A multi－center blinded prospective study of urine neural thread protein measurements in patients with suspected Alzheimer′s disease［J］.AMDA，2007，8(1):21－30.

［3］ Deighan DJ， Clarke BF， Griffin RM， et al. Interleukin－4 mediates the neuroprotective effects of rosiglitazone in the aged brain［J］.Neurobiol Aging，2009，30(6):920－ 931.

［4］ de la Monte SM，Wands JR.Alzheimer－associated neuronal thread protein mediated cell death is linked to impaired insulin signaling［J］.Alzheimers Dis，2004，6(3):231－242.

［5］ Deng YQ，Li B，Liu Y，et al.Dysregulation of insulin signaling，glucose transporters，O－GlcNAcylation，and phosphorylation of Tau and neurofilaments in the brain［J］.Am J Pathol，2009，175(5):2089－2098.

［6］ 王宏娟，王蓉.AD7c－NTP—一種阿爾茨海默病的生物標(biāo)記物［J］.中國老年學(xué)雜志，2007，4(27):699－701.

［7］ Sylvia E，Perez，Saleem Dar， et al.Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1dE9 transgenic mouse［J］.Neurobiol Dis，2007，28(1):3－15.

［8］ Begum AN，Jones MR，Lim GP，et al.Curcumin structurefunction， bioavailability， and efficacy in models of neuroinflammation and Alzhermer’s disease［J］.Pharmacol Exp Ther，2008，326(1):196－208.

［9］ Savonenko A，Xu GM， Melnikova T，et al.Episodic－like memorydeficitsin the APPswe/PS1dE9 mouse modelof Alzheimer＇s disease:relationships to beta－amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities［J］.Neurobiol Dis.2005，18(3):602－617.

［10］ Ono K，Hasegawa K，Naiki H，et al.Curcumin has potent antiamyloidogenic effects for Alzheimer’s beta－amyloid fibrils in vitro［J］.Neurosci Res.2004，75:742－750.

［11］ Sikora E，Bielak－Zmijewska A，Mosieniak G，et al.The promise of slow down ageing may come from curcumin［J］.Curr Pharm Design，2010，16(7):884－892.

［12］ Ma QL，Yang F，Rosario ER，et al.Beta－amyloid oligomers induce phosphorylation of tau and inactivation of insulin receptor substrate via c－Jun N－terminal kinase signaling:Suppression by omega－3 fatty acids and curcumin［J］.Neurosci，2009，29:9078－9089.

Effect of Curcumin on Urine Concentration of AD7C-NTP in APP/PS1 Double Transgenic Mice

LI Rui－sheng，LI Yong，WANG Hong，REN Ying，ZHU Zhi－h(huán)ui，SUN Hai－yun，YANG Jin－duo，WANG Peng－wen
(The Herbal Pharmacology Laboratory，Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of curcumin on Alzheimer's disease by dynamical detection of the changes of the concentration of Alzheimer－associated neuronal thread protein(AD7C－NTP)in mouse urine.MethodsA total of 35 three－month－old APP/PS1 double transgenic mice were randomized into 5 groups(n=7):model group，positive control group(rosiglitazone)，high，medium and low dose curcumin groups.C57BL/6J mice in the same age and genetic background as APP/PS1 double transgenic mice were used as normal control group(n=7).All the 6 groups of mice were intragastrically administered for 3 consecutive months.Urine samples were collected on the day before，and 30，60 and 90 days after intragastric administration，respectively.The changes of urinary AD7c－NTP concentration was detected by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsComparison of the AD7C－NTP concentrations in each group of mice:The AD7C－NTP concentration in the positive control group，high，medium and low dose curcumin groups at 60 days time point was significantly decreased than that at 30 days time point(P ＜0.05，P ＜0.01).Comparison of AD7C－NTP concentrations at the same time point among different groups:compared with the model group，the AD7C－NTP concentration of positive control group，high and low dose curcumin groups was significantly deceased after 2－month treatment(P ＜ 0.05，P ＜ 0.01).ConclusionCurcumin can decrease urinary AD7C－NTP concentration in AD model mice and delay progression of Alzheimer’s disease.

Curcumin;APP/PS1 double transgenic mouse;AD7C－NTP;Alzheimer's disease

Q95－3，R－332

A

1005－4847(2010)05－0406－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.10

2010－02－24

北京市自然基金資助項目(No.7092057);高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智基地(111計劃)教育部和國家外國專家局［B08006］資助項目。

李瑞晟(1982－)，男，在讀碩士研究生，中藥藥理研究方向。

王蓬文，女，教授，主要從事神經(jīng)元變性病的發(fā)病機制及防治對策研究。