鹽巴戟天炮制工藝的優(yōu)化

鄒 兵 馬雪松 佟連琨 姜永糧*

1 遼寧省鞍山市食品藥品檢驗(yàn)所（114006）

2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（110032）

3 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)（116600）

巴戟天為茜草科植物巴戟天（Morinda officinalis How.）的干燥根，味甘辛，性微溫，有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效[1]。巴戟天始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，歷代本草均有記載。是我國著名的“四大南藥”之一，用于陽痿遺精，宮冷不孕，月經(jīng)不調(diào)，少腹冷痛，風(fēng)濕痹痛，筋骨痿軟等癥。巴戟天中含有蒽醌、多糖、寡糖、脂類、有機(jī)酸等11類化合物及24種無機(jī)元素[2]。巴戟天的化學(xué)成分及其藥理作用已有部分研究[3,4]，陳小娟等[5]探討了巴戟多糖的免疫作用，認(rèn)為其能增加幼年小鼠的胸腺的重量，提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬百分率和小鼠脾臟免疫特異玫瑰花結(jié)形成細(xì)胞的形成；巴戟天多糖可以提高果蠅性活力，并顯著提高果蠅新生幼蟲的羽化率，認(rèn)為巴戟天多糖具有明顯的補(bǔ)腎壯陽作用[6]。巴戟天寡糖具有明顯的補(bǔ)腎壯陽作用，屬于巴戟天補(bǔ)腎壯陽作用的有效成分之一[7]。臨床上一般用鹽巴戟天，炮制后寡糖變化如何？尚無人考察，因此我們測定了巴戟天中補(bǔ)腎壯陽的主要成分耐斯糖和多糖的含量，并以此為指標(biāo)確定了鹽巴戟天的炮制工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AB液相色譜儀；LC-Solution色譜數(shù)據(jù)工作站；電霧式檢測器（美國惠澤公司）；UV-3010紫外分光光度計(jì)；METTLER AE240型十萬分之一分析天平（瑞士METTLER）。

1.2 試藥

生品巴戟天藥材購自廣東德慶種植基地，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為茜草科植物巴戟天（Morinda officinalis How.）的干燥根；鹽（市售）；耐斯糖對照品（購自sigma公司，純度＞98%）；D-無水葡萄糖對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110833-200503）。

2 方法與結(jié)果

2.1 耐斯糖含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

取耐斯糖對照品適量，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動(dòng)相，甲醇-水 （3∶97），制成每1mL含0.2148mg的溶液，即得。

2.1.2 鹽巴戟天樣品的制備

取凈巴戟天，加鹽水拌勻，置適宜的容器內(nèi)，加熱蒸透或至規(guī)定的程度時(shí)，趁熱除去木心，切段，干燥[8]。

2.1.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相50mL，密塞，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液即得[9]。

2.1.4 測定條件

色譜柱：Diamonsil C18（5 μm，250mm×4.6mm）；流動(dòng)相∶甲醇-水 （3∶97）；柱溫：30℃；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

在上述色譜條件下，該分析條件良好，符合定量分析要求。耐斯糖對照品、生品巴戟天及鹽巴戟天HPLC色譜圖分別見圖1。

圖1 巴戟天HPLC圖

2.1.5 線性范圍考察

取耐斯糖對照品適量，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動(dòng)相，甲醇-水 （3∶97），制成每1mL含0.2148mg的溶液，即得。

精密吸取濃度為0.2148mg的耐斯糖對照品溶液10、20、30、40、50μL，進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積分別為830474、1536942、2163688、2832726、3462176。以耐斯糖對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，耐斯糖色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得耐斯糖線性回歸方程為：Y＝305363X-197445，相關(guān)系數(shù)r＝0.9998。表明耐斯糖的進(jìn)樣量在2.148～10.740μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述配制的耐斯糖對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μL，按上述色譜條件，測定色譜峰面積，RSD為1.4%，測定結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)精密度符合有關(guān)規(guī)定。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按2.1.3，2.1.4項(xiàng)下制備供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液各10μL，分別在0時(shí)、4時(shí)、8時(shí)、12時(shí)、16時(shí)、24時(shí)，進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積，RSD為1.6%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品制備后24h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取巴戟天樣品粉末6份，按2.1.3、2.1.4項(xiàng)下制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，結(jié)果RSD為1.8%測定結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知耐斯糖含量的鹽巴戟天樣品6份，每份約0.25g精密稱定，分別精密加入耐斯糖對照品適量，按2.1.3、2.1.4項(xiàng)下制成供試品溶液，測定結(jié)果表明，耐斯糖平均回收率為100.73%，RSD為1.3%。測定結(jié)果符合有關(guān)規(guī)定。

2.2 巴戟天中多糖的含量測定

2.2.1 巴戟天多糖的精制

稱巴戟天（三號篩）50g，加80%乙醇200mL浸漬24 h，85℃回流提取2次，每次1.5 h，過濾，藥渣加蒸餾水500mL浸泡1 h；90℃溫浸50min，抽濾，濾渣加120mL蒸餾水浸泡過夜，過濾，合并濾液；在電子萬用爐上加熱，濃縮至70mL，每30mL濃縮液加10mL氯仿萃取，萃出液呈棕色黏稠液；合并濃縮液約70mL加入0.75g活性炭脫色，加熱90℃抽濾，濾液濃縮至60mL，加95%乙醇250mL搖勻，靜置于冰箱；過濾，以95%乙醇多次洗滌，無水乙醇，乙醚，丙酮每次10mL 3次洗滌，60℃烘干，備用[10]。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密量取10.0mg D-無水葡萄糖于250mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，制成濃度為0.1mg/mL儲備液。

2.2.3 測定條件

按制備方法項(xiàng)下操作制備對照液、供試液和空白液，在400～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，均在484nm處均有最大吸收值，故選定484nm作為含量測定的最大波長。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（100mg/L）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL于25mL具塞比色管中，加蒸餾水至2.00mL，再各加5%苯酚溶液1.60mL搖勻，迅速加入濃H2S04溶液7.50mL，振搖5min，放置10min，置沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫；于484nm，以試劑空白為參比測定吸光度。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=11.79X+0.0155，r=0.9997，結(jié)果表明，D-無水葡萄糖溶液濃度在0.005～0.06mg/mL的范圍內(nèi)與與吸收值有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 換算因子的測定

精密稱取已制備巴戟天多糖5.0mg，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻制得巴戟天多糖儲備液；吸取多糖儲備液2.0mL，置于10mL容量瓶中，加水定容；吸取上述溶液2.0mL加5%苯酚溶液1.60mL搖勻，迅速加入濃H2S04溶液7.50mL，振搖5min，放置10min，置沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫；于484nm，以2.0mL水作空白對照，測定吸光度，由回歸方程求出此巴戟天多糖儲備液中葡萄糖的濃度，按如下公式求換算因子：f=m/（C×D×V），式中m為巴戟天多糖的質(zhì)量（mg），C為巴戟天多糖儲備液中葡萄糖濃度（mg/L），D為巴戟天多糖的稀釋倍數(shù)，V為體積（mL）[10]（表1）。

表1 換算因子的測定

由表可得，換算因子平均值為1.2361，RSD=0.12%，表明精密度良好。

2.2.6 供試品溶液的制備

取鹽巴戟天樣品適量，粉碎，取過三號篩約0.2000g，于圓底燒瓶內(nèi)，加150mL 80%的乙醇，于90℃水浴回流1h，過濾，濾渣中加150mL蒸餾水，90℃水浴1h，過濾，殘?jiān)脽崴?次，每次10mL，合并濾液，轉(zhuǎn)入250mL容量瓶中，定容。吸取2mL用蒸餾水定容至10mL，即得供試品溶液。

2.2.7 樣品的測定

吸取供試品溶液2.0mL，按2.2.4項(xiàng)下的操作，依據(jù)回歸方程求供試品液的濃度，并且轉(zhuǎn)換成百分含量。多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) W% = （C×D×f/m ）×100%，式中： C為葡萄糖的濃度，D為多糖稀釋因素，f為換算因子，m為樣品質(zhì)量。

2.2.8 精密度試驗(yàn)

取一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述條件，連續(xù)6次測定吸光度，測定RSD 為1.0%，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)精密度符合有關(guān)規(guī)定。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液2.0mL，按照2.2.4項(xiàng)下方法顯色后，室溫下放置，在上述光譜條件下于0、2、4、6、8、10、12h時(shí)間間隔，分別測定樣品吸光度，測定RSD為1.7%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品組分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取巴戟天樣品粉末六份，按2.2.6項(xiàng)下制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)行測定六次，計(jì)算總多糖含量，測定RSD為0.8%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn)

取已知多糖含量的巴戟天樣品6份，每份約0.1g，分別加入D-無水葡萄糖對照品適量，按2.2.6、2.2.7項(xiàng)下操作，測定樣品吸光度，葡萄糖平均回收率為99.92%，RSD為1.3%，結(jié)果符合有關(guān)要求。

3 鹽巴戟天工藝優(yōu)選

3.1 鹽巴戟天樣品的制備

取藥材每份50g，于煤氣爐上密閉按鹽蒸要求用蒸鍋蒸制。

3.2 樣品溶液的制備及測定

按2.1.3、2.2.6項(xiàng)下要求制備各供試品溶液。并分別于2.1.4、2.2.3及2.2.4項(xiàng)下條件測定耐斯糖及巴戟天中多糖的含量，進(jìn)行分析。

3.3 單因素考察

3.3.1 鹽溶液用量考察

取生品巴戟天5份，每份50g，置密閉容器內(nèi)，分別加入已配好的2%鹽溶液30、40、50、60、70mL，拌勻悶潤，待鹽水被吸盡后，蒸30min后出鍋，烘干，粉碎，過60目篩，備用。取各樣品，按上述供試品溶液的制備方法和色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

由表2可以看出在加鹽水量為每50g藥材用鹽水50mL時(shí)，指標(biāo)性成分含量的綜合評分最高，因此選擇50mL鹽水為最佳，進(jìn)行下一組單因素考察。

表2 溶液用量考察結(jié)果（n=3）

3.3.2 鹽用量考察

取5份生品，每份50g，置蒸鍋內(nèi)，分別加入用不同鹽量配制的溶液50mL，悶潤，待鹽水吸盡后，蒸30min后出鍋，烘干，粉碎，過60目篩，備用。

取各炮制品粉末，按上述實(shí)驗(yàn)方法中指標(biāo)性成分含量測定項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法和條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表3

表3 鹽用量（%）考察結(jié)果（n=3）

由表3可知，鹽用量是影響巴戟天指標(biāo)性成分的因素，加鹽量2%的巴戟天炮制品為最佳，故選鹽量為2%進(jìn)行下一組單因素考察。

3.3.3 悶潤時(shí)間考察

取5份生品，每份50g，置蒸鍋內(nèi)，加入2%鹽溶液50mL，悶潤不同時(shí)間，待鹽水吸盡后，蒸30min后出鍋，烘干，粉碎，過60目篩，備用。

取各炮制品粉末，按上述實(shí)驗(yàn)方法中指標(biāo)性成分含量測定項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法和條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表4。

表4 悶潤時(shí)間考察結(jié)果（n=3）

由表4可知，悶潤時(shí)間是影響巴戟天指標(biāo)性成分的因素，悶潤4h為最佳，故選悶潤4h進(jìn)行下一組單因素考察。

3.3.4 蒸制時(shí)間考察

取5份生品，每份50g，置蒸鍋內(nèi)，加入2%鹽溶液50mL，悶潤4h，待鹽水被吸盡后，蒸制不同時(shí)間后出鍋，烘干，粉碎，過60目篩，備用。

取各樣品粉末，由上述實(shí)驗(yàn)方法的制備方法和條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表5。

由表5可知，蒸制時(shí)間是影響巴戟天指標(biāo)性成分的因素，結(jié)果為蒸制時(shí)間60min的巴戟天綜合評分最高。

4 正交實(shí)驗(yàn)

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，鹽水用量、加鹽量、悶潤時(shí)間和蒸制時(shí)間均對巴戟天有效成分均有影響，故以加鹽量、悶潤時(shí)間和蒸制時(shí)間為考察因素，以耐斯糖和巴戟天中多糖的含量為指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表6，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表7，方差分析表見表8。

表5 蒸制時(shí)間考察結(jié)果（n=3）

表6 因素水平表

表7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表8 方差分析表

由正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果可知，鹽巴戟天的影響因素主次順序?yàn)椋篈 ＞C＞B ，即加鹽量＞蒸制時(shí)間＞悶潤時(shí)間；且 A、C因素為顯著因素，即加鹽量和蒸制時(shí)間對耐斯糖和多糖的含量變化有顯著影響。而因素B 對耐斯糖和多糖的含量變化無顯著影響。所以，確定鹽巴戟天炮制工藝為A1B3C2，即50g藥材加入50mL 2%的鹽水拌勻悶潤5h，加熱蒸制60min，趁熱除去木心，切段，干燥。

5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按優(yōu)選的最佳炮制工藝制備3份樣品，按上述實(shí)驗(yàn)制備方法和條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表9。由表9可見，樣品1、2和3的耐斯糖和多糖含量均較高，與正交試驗(yàn)結(jié)果相符，說明鹽巴戟天炮制工藝穩(wěn)定可行。

表9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6 討論與結(jié)論

6.1 2005年版中國藥典收載的巴戟天炮制品為巴戟天、巴戟肉、鹽巴戟天和甘草制巴戟天4種[8]，且以巴戟肉、鹽巴戟天和甘草制巴戟天為主流飲片規(guī)格[11]。巴戟天的炮制特點(diǎn)是借助所用輔料固有的作用，以增強(qiáng)其壯陽、補(bǔ)益功能，并獲得滿意療效，用鹽取其下行入腎，增強(qiáng)補(bǔ)腎助陽、強(qiáng)筋健骨的作用[12]。鹽制巴戟功專入腎，溫而不燥，增強(qiáng)了補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋健骨作用[11]。

6.2 巴戟天低聚糖類物質(zhì)具有顯著的抗抑郁活性和補(bǔ)腎助陽的作用，但由于糖類檢測的局限性，對這類成分炮制后變化的分析一直未見報(bào)道。本文采用新型的通用型檢測器-電霧式檢測器（CAD），用HPLC法分析巴戟天中低聚糖耐斯糖，結(jié)果表明巴戟天中耐斯糖炮制后含量增加，這和文獻(xiàn)資料記載鹽制品增強(qiáng)補(bǔ)腎陽功能較為吻合。

6.3 巴戟天中多糖為活性成分，所含的多糖有增強(qiáng)免疫和補(bǔ)腎助陽的作用，炮制過程有利于多糖的溶出，起到增效作用，但蒸制時(shí)間過長多糖會(huì)散失，故蒸制時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制。本實(shí)驗(yàn)用一定濃度的食鹽水悶潤巴戟天至一定時(shí)間后蒸制，工藝簡便、易于操作、工藝參數(shù)可控，并能保證炮制品的質(zhì)量。蒸制時(shí)間對多糖有較顯著的影響，生品經(jīng)蒸制多糖含量升高，至30min達(dá)到最高，但隨時(shí)間延長，多糖含量則呈下降趨勢，60min后下降明顯，說明巴戟天的蒸制時(shí)間應(yīng)控制在60min內(nèi)，以保證有效成分的含量。

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