羧甲基殼聚糖的制備及其在保鮮中的應(yīng)用

朱昌玲，史勁松，孫達(dá)峰，張 和，戚善龍

(1.南京野生植物研究院，江蘇南京210042;2.揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚(yáng)州225001)

羧甲基殼聚糖的制備及其在保鮮中的應(yīng)用

朱昌玲1，史勁松1，孫達(dá)峰1，張 和2，戚善龍2

(1.南京野生植物研究院，江蘇南京210042;2.揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚(yáng)州225001)

研究了在堿性條件，無(wú)溶劑體系下殼聚糖羧甲基化制備工藝，通過(guò)IR對(duì)反應(yīng)前后殼聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。最佳反應(yīng)條件：2 g殼聚糖，在NaOH加入量為5 g、堿化時(shí)間為6h、氯乙酸用量為6g、3%KI、反應(yīng)時(shí)間為8 h、反應(yīng)溫度60℃，產(chǎn)品取代度為1.27。同時(shí)研究了羧甲基殼聚糖對(duì)辣椒、豬肉涂膜保鮮實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示對(duì)辣椒、豬肉具有較好的涂膜保鮮作用。

殼聚糖;羧甲基化反應(yīng);保鮮

殼聚糖(Chitosan，Cts)是甲殼素脫乙酰后的產(chǎn)物，是一種天然堿性多糖，由于只能溶解于酸及酸性水溶液中，限制了它的理論研究及生產(chǎn)應(yīng)用。但殼聚糖具有優(yōu)良的生物親和性和生物可降解性，容易制成各種衍生物［1］。在眾多衍生物中羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl－chitosan，CMC)研究最早，也最引人注目。羧甲基殼聚糖是將羧甲基引入殼聚糖而得到的一類殼聚糖衍生物，通過(guò)羧甲基改性，可以破壞殼聚糖分子間的氫鍵，增加其水溶性。使其既能溶于酸中，又能溶于堿中，成為聚兩性電解質(zhì)，從而大大擴(kuò)大了殼聚糖的應(yīng)用范圍［2］。由于CMC的水溶性比甲殼素和殼聚糖好，從而得到更好的發(fā)揮功效，可用作化妝品的保濕劑、果蔬保鮮劑、植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、水處理絮凝劑及多種藥物輔劑等［3］。

根據(jù)文獻(xiàn)［4－10］報(bào)道，在制備羧甲基殼聚糖時(shí)，均需加入異丙醇、1，4－二氧六環(huán)、二甲亞砜(DMSO)等其中一種有機(jī)溶劑進(jìn)行膨化，生產(chǎn)時(shí)也不利于乙醇的回收利用。本文對(duì)其制備工藝及條件加以改進(jìn)，在不加膨化劑的基礎(chǔ)上對(duì)制備條件進(jìn)行了研究，優(yōu)化出了最佳制備條件。

由于殼聚糖只能溶解于酸和酸性水溶液中，酸性水溶液損傷了果蔬表層，在很大程度上限制了它在果蔬涂膜保鮮上的應(yīng)用。羧甲基殼聚糖溶于水，在水溶液中容易形成牢固的膜，此膜對(duì)氣體有選擇滲透性，特別適于果蔬保鮮［11］，現(xiàn)將制備的產(chǎn)品對(duì)辣椒進(jìn)行保鮮實(shí)驗(yàn)。另外根據(jù)其抑菌作用，也進(jìn)行了豬肉保鮮探索，以期能為羧甲基殼聚糖應(yīng)用于果蔬、肉食保鮮提供一定的基礎(chǔ)資料依據(jù)。

1 材料與方法

1.2 儀器與試劑

儀器：離心機(jī)、磁力攪拌器、真空干燥箱、烘箱、PB－10型酸度計(jì)、NDJ－1旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)、水浴加熱器等;Nicolet670傅立葉變換紅外光譜儀，KBr壓片，掃描范圍為4 000～400 cm－1，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm－1。

殼聚糖：由揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司提供，食品級(jí)、脫乙酰度≥90%;

辣椒：市場(chǎng)購(gòu)買，沒(méi)有機(jī)械損傷、沒(méi)有病蟲害、個(gè)頭較大、均勻厚實(shí)硬朗的新鮮辣椒;

豬肉：市場(chǎng)購(gòu)買新鮮豬肉;

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純;乙醇為95%、食品級(jí)。

1.3 方法

1.3.1 測(cè)定方法

1.3.1.1 羧甲基殼聚糖取代度的測(cè)定［4］

精確稱取0.5 g干燥至恒重的羧甲基殼聚糖于250 mL容量瓶中，精確移取50 mL 0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于其中，振搖，使完全溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，同時(shí)用pH計(jì)測(cè)pH值。

取代度的計(jì)算公式如下：

式中：A—每克樣品中羧甲基的物質(zhì)的量，mmol;

V1—pH值為2.1時(shí)滴定所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;

V2—pH值為4.3時(shí)滴定所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;

W—樣品凈重，g;

M—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L。

1.3.1.2 辣椒失重率的測(cè)定

每次任意取出每組中的一只，稱取辣椒的重量。

式中：m0—第1天辣椒的質(zhì)量;

mn—第N天辣椒的質(zhì)量。

1.3.1.3 辣椒硬度的觀察

物理觀察法，用肉眼觀察辣椒的變化后進(jìn)行描述記錄。

1.3.1.4 豬肉感官指標(biāo)

無(wú)異味，無(wú)酸敗味。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.2.1 羧甲基殼聚糖的制備

稱取2 g殼聚糖于三角瓶中，緩慢加入一定體積的40%NaOH溶液，攪勻，在常溫下進(jìn)行堿化。加入催化劑。稱取一定量的氯乙酸，分3次投入已堿化的溶液中，每次間隔10 min，然后加熱進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后加入一定量的蒸餾水，冷卻至室溫，用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值至7。將溶液在4000 r/min下，離心15 min，取其上清液。在攪拌狀態(tài)下，將上清液緩慢加入到150 mL 95%乙醇中，靜置2 h，抽濾除去溶劑，用70%左右的乙醇洗滌3次，在60℃下真空烘干，粉碎即得灰白色粉狀羧甲基殼聚糖成品。

1.3.2.2 羧甲基殼聚糖的涂膜保鮮實(shí)驗(yàn)

(1)辣椒保鮮

將辣椒用清水清洗，自然涼干。隨機(jī)分成2組，每組6只。第一組：水洗處理，作為對(duì)照;另一組：用加一定量的甘油等，配制成的2%羧甲基殼聚糖溶液進(jìn)行涂膜處理。

分別放入溶液中浸泡1 min，取出晾干，置于室溫下(實(shí)驗(yàn)在夏季，室溫25～30℃)并在塑料薄膜中貯藏。每隔兩天進(jìn)行測(cè)一次理化指標(biāo)。

(2)豬肉保鮮

將豬肉在自來(lái)水下反復(fù)沖洗干凈后，用75%酒精擦拭刀具和案板，切成約50 g/塊，分別在下列幾組實(shí)驗(yàn)液中浸泡2 min，取出瀝干后裝在聚苯乙烯泡沫托盤中，用低密度聚乙烯保鮮薄膜加以覆蓋，貯存在(3±1)℃冰箱中，每隔2 d測(cè)定其指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)分組為：Ⅰ、對(duì)照組，用無(wú)菌蒸餾水;Ⅱ、pH為4.5醋酸緩沖液溶液;Ⅲ、1.0%羧甲基殼聚糖;Ⅳ、用pH為4.5醋酸緩沖液溶液，配制的1.0%羧甲基殼聚糖。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧甲基殼聚糖的制備條件的優(yōu)化

2.1.1 催化劑對(duì)羧甲基化反應(yīng)的影響

固定其它反應(yīng)條件，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇了3種催化劑，對(duì)其催化作用進(jìn)行比較。結(jié)果如表1：

表1 催化劑對(duì)羧甲基化反應(yīng)的影響

從表1中看出，KI的催化作用相當(dāng)明顯。因?yàn)镵I與C1CH2COONa反應(yīng)生成ICH2COONa，由于I－的離去能力大于Cl－，因此ICH2COONa更容易與殼聚糖反應(yīng)，生成羧甲基殼聚糖，但催化劑量繼續(xù)增加，ICH2COONa水解副反應(yīng)也會(huì)增強(qiáng)。

2.1.2 堿化時(shí)間對(duì)產(chǎn)品的影響

在氯乙酸用量為4 g，反應(yīng)時(shí)間為5 h，反應(yīng)溫度60℃時(shí)，改變殼聚糖的堿化時(shí)間，對(duì)所得產(chǎn)品的取代度影響進(jìn)行研究，結(jié)果如圖1所示：

圖1 堿化時(shí)間對(duì)產(chǎn)品取代度的影響

從圖1得知，隨著殼聚糖堿化時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品取代度增大，水溶性逐漸變好，但4 h后增加不明顯，所以取6h為最佳堿化時(shí)間。

另外，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得知，羧甲基殼聚糖取代度在0.5以上時(shí)，即可全部水溶。

2.1.3 氯乙酸用量比對(duì)產(chǎn)品的影響

在堿化時(shí)間為6h，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間為5 h時(shí)，改變氯乙酸用量，對(duì)產(chǎn)品的取代度影響見圖2所示：

圖2 氯乙酸用量對(duì)產(chǎn)品取代度的影響

取代度隨氯乙酸用量的增加而增加，水溶性也隨著變好，但當(dāng)氯乙酸用量增加到一定程度時(shí)，取代度增大變緩。因?yàn)轸燃谆磻?yīng)主要包括兩種反應(yīng)：一是氯乙酸與堿的中和及水解反應(yīng)(副反應(yīng));二是氯乙酸鈉與堿化CTS的反應(yīng)。氯乙酸用量增加，發(fā)生羧甲基化反應(yīng)的幾率增加，導(dǎo)致DS上升，但當(dāng)氯乙酸用量繼續(xù)增加時(shí)，過(guò)量氯乙酸中和了部分NaOH，不利于羧甲基化反應(yīng)。由此可見，氯乙酸較適宜的用量為6g。

另外，羧甲基化反應(yīng)是一個(gè)放熱反應(yīng)，如果操作過(guò)程中將氯乙酸一次加入，反應(yīng)十分激烈，很難控制其反應(yīng)溫度，而且氯乙酸利用率降低。為此，采用分次加入氯乙酸的方法，可有效的提高反應(yīng)效率。

2.1.4 堿用量對(duì)取代度的影響

在浸泡時(shí)間為6h，氯乙酸用量為6g，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間5 h時(shí)，改變氫氧化鈉用量，對(duì)產(chǎn)物取代度影響結(jié)果見圖3：

圖3 氫氧化鈉用量對(duì)羧甲基化反應(yīng)的影響

由圖可見，隨著氫氧化鈉用量的增加，羧甲基殼聚糖的取代度均呈遞增趨勢(shì)，但是堿用量過(guò)大時(shí)，取代度反而下降了。因?yàn)轸燃谆磻?yīng)是在堿性環(huán)境下進(jìn)行的，反應(yīng)體系中堿量的增大，有利于殼聚糖結(jié)構(gòu)單元中更多活性中心形成，產(chǎn)物取代度相應(yīng)提高。同時(shí)也會(huì)提高副反應(yīng)的發(fā)生率，降低氯乙酸的利用率。當(dāng)氫氧化鈉用量為5 g時(shí)，取代度達(dá)到最大。

另外，實(shí)驗(yàn)中得知堿量的增加對(duì)產(chǎn)品的粘度和色澤沒(méi)有顯著的影響。

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)羧甲基化反應(yīng)的影響

在確定氫氧化鈉用量為5 g，加入3%KI，其他反應(yīng)條件不變的情況下，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物取代度的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)羧甲基化反應(yīng)的影響

隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，取代度呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)8 h后此趨勢(shì)變化緩慢，因此取最佳反應(yīng)時(shí)間為8 h。

2.1.6 反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響

在反應(yīng)時(shí)間為8 h，其他反應(yīng)條件不變，研究反應(yīng)溫度的變化對(duì)產(chǎn)物取代度的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)羧甲基化反應(yīng)的影響

由圖5可知，升高反應(yīng)溫度有利于殼聚糖的羧甲基化，當(dāng)溫度升高至60℃時(shí)，所得產(chǎn)品的取代度達(dá)到最高，超過(guò)此溫度產(chǎn)品的取代度反而下降。因?yàn)榉磻?yīng)溫度的升高使活性中心發(fā)生羧甲基反應(yīng)的幾率提高，進(jìn)而取代度有所提高，但溫度高于60℃時(shí)，氯乙酸的水解加快，使氯乙酸利用率低不利于取代反應(yīng)的進(jìn)行。

2.2 IR分析

圖6 殼聚糖的紅外譜圖

圖7 羧甲基殼聚糖的紅外譜圖

從圖中可以看出，在羧甲基殼聚糖中1 602.7 cm－1、1 424.51 cm－1處出現(xiàn)了羧基鈉鹽的特征峰，分別為—COONa不對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。在殼聚糖中 1 597.7 cm－1、1 654.62 cm－1為—NH2的變形振動(dòng)雙峰，在羧甲基殼聚糖中變成單峰，是氨基發(fā)生羧甲基化的標(biāo)志。再則，在殼聚糖中的3 449.48 cm－1處的寬峰是—OH、—NH2的伸縮振動(dòng)峰，取代后峰變?nèi)?，說(shuō)明—OH、—NH2被取代。另外圖7中還存在1 054.29 cm－1處的C—O—C基團(tuán)的吸收峰，這是羧甲基殼聚糖的特征峰，進(jìn)一步說(shuō)明殼聚糖發(fā)生了羧甲基化反應(yīng)。

2.3 羧甲基殼聚糖的涂膜保鮮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 辣椒保鮮

2.3.1.1 辣椒涂膜處理后對(duì)外觀的影響

表2 涂膜處理對(duì)辣椒外觀的影響

從表2可以看出，辣椒進(jìn)行羧甲基殼聚糖涂膜處理后，外觀情況明顯改觀。因?yàn)榻?jīng)羧甲基殼聚糖溶液涂膜后，能在其表面現(xiàn)成一層均勻的半透明薄膜，從而使果實(shí)在特定的“小氣候”環(huán)境下保存。另外其溶液有一定的抑菌作用。

2.3.1.2 涂膜處理后對(duì)辣椒失重率的影響

表3 涂膜處理對(duì)辣椒失重率的影響

表3說(shuō)明，辣椒進(jìn)行羧甲基殼聚糖溶液涂膜處理后，失重也明顯改善。水是維持細(xì)胞正常機(jī)能，保持果蔬新鮮的必要條件，失水是造成果蔬細(xì)胞生理功能降低，有害物質(zhì)增多，最終導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞的主要原因。

2.3.2 豬肉保鮮

表4 豬肉的感官測(cè)定

從表4看出，醋酸緩沖液處理對(duì)豬肉保鮮有一定作用，但其效果明顯低于羧甲基殼聚糖。與醋酸緩沖液的低pH酸抑制微生物生長(zhǎng)的機(jī)制不同，羧甲基殼聚糖的保鮮作用在于其成膜性和抑菌特性，達(dá)到保鮮目的。醋酸緩沖液、羧甲基殼聚糖進(jìn)行綜合利用，效果更佳。

用pH為4.5醋酸緩沖液溶液，配制的1.0%羧甲基殼聚糖對(duì)新鮮豬肉進(jìn)行涂膜處理，豬肉在(3±1)℃貯藏條件下，其腐敗時(shí)間可以延長(zhǎng)12 d。

3 結(jié)論

(1)在制備羧甲基殼聚糖時(shí)，不加入異丙醇、1，4－二氧六環(huán)、二甲亞砜(DMSO)等其中一種有機(jī)溶劑進(jìn)行膨化，同樣可以得到取代度較高的產(chǎn)品。2 g殼聚糖，在NaOH加入量為5 g、堿化時(shí)間為6h、氯乙酸用量為6g、3%KI、反應(yīng)時(shí)間為8 h、反應(yīng)溫度60℃，所得產(chǎn)品的取代度最高為1.27;

(2)通過(guò)IR分析，說(shuō)明殼聚糖發(fā)生了羧化反應(yīng);

(3)用羧甲基殼聚糖分別對(duì)辣椒、豬肉進(jìn)行涂膜保鮮實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)辣椒外觀、失重率的測(cè)試比較，證明其對(duì)辣椒有很好的涂膜保鮮作用;通過(guò)對(duì)豬肉的感官測(cè)定比較，證明其對(duì)豬肉有很好的涂膜保鮮作用。

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Study on Preparation of Carboxymethyl Chitosan and its Application to the Preservation

Zhu Changling1，Shi Jingsong1，Sun Dafeng1，Zhang He2，Qi Shanlong2
(1.Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plant，Nanjing 210042，China;2.Ltd.Yangzhou Rixing Biotechnology Co.，Yangzhou 225001，China)

Carboxymethyl chitosan was synthesized at basic pH without solvent.The molecular conformation of modified chitosan was characterized by FTIR before and after the reaction.The optimum reaction conditions were as follows： alkalization time 6h;mass ratio of chloroacetic acid to chitosan 3∶1;NaOH 2.5∶1;3%KI，reaction temperature 60℃;reaction time 8 h.Carboxymethyl chitosan was obtented with a degree of substitution over 1.27.Further experiment results proved that carboxymethyl chitosan prepared had a very good preservation on film coating antistaling.

Chitosan;Carboxymethytlation;Preservation

O636.1

A

1006－9690(2010)03－0041－05

10.3969/j.issn.1006－ 9690.2010.03.010

2009－09－15

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)資金項(xiàng)目(BA2009103)。