D－半乳糖建造老年性聾動物模型

陳十燕，陳賢明，，羅 萍，肖 麗

(1.福建醫(yī)科大學(xué)福州總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350025;2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，福州 350025)

D－半乳糖建造老年性聾動物模型

陳十燕1，陳賢明1，2，羅 萍2，肖 麗2

(1.福建醫(yī)科大學(xué)福州總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350025;2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，福州 350025)

目的 研究D－半乳糖建造老年性聾模型的理想方式。方法 健康wistar大鼠50只，隨機分為5組，即對照組和四個不同劑量D－半乳糖(50、100、200、500 mg/kg)建造的老年性聾模型組。觀察各組動物行為檢測(興奮性實驗)、ABR反應(yīng)閾、血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性、聽皮層中的神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果 各模型組較對照組探究能力明顯下降，但緊張度無明顯改變。血清中MDA含量和SOD活性與對照組比較有顯著性升高(P＜0.05)，但 ABR閾值和Ⅰ、Ⅲ波潛伏期僅500 mg/kg組顯著升高延長，其他模型組與對照組均無顯著性差異。并且模型組中僅500 mg/kg組聽皮層出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞稀少、腫脹，尼氏小體減少的現(xiàn)象。結(jié)論 D－半乳糖(500 mg/kg)腹腔注射每天一次持續(xù)10周造模是建造老年性聾動物模型的有效方法。

wistar大鼠;老年性聾;D－半乳糖;模型，動物

老年性聾是指因年齡的增長，聽覺器官隨同身體其他組織器官一起所發(fā)生的緩慢進行性老化過程，并出現(xiàn)聽力減退的生理現(xiàn)象。它是自然老化過程，聽力損失以高頻為主。在老年性聾的實驗研究中，國內(nèi)外多是采用經(jīng)臨床證實的人類老年性聾患者及自然衰老的動物，以老年性聾模型作為研究對象并不多見。用人類老年性聾患者和自然衰老的動物作為實驗對象具有一定的局限性，一是研究對象不容易獲取，而且樣本量收集的時間較長。二是在病理方面研究其發(fā)展變化用人類老年性聾患者是不可行的，所以制備老年性聾動物模型是很有必要的。國內(nèi)有多家學(xué)者提出D－半乳糖構(gòu)建老年性聾動物模型，但其動物的選取、給藥的方式、劑量和時間有很大差異。本實驗通過不同劑量D－半乳糖建造老年性聾模型并對該造模條件進行比較，為老年性聾的研究提供一個可靠、簡便易行的實驗動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

選用耳廓反射靈敏的健康Wistar大鼠(月齡2～3個月)50只，體重180～200 g，由上海斯萊克實驗動物公司提供［SCXK(滬)2007－0005］。D－半乳糖購于Sanland公司。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。甲苯胺藍購于 Amresco公司。50只大鼠隨機分為5組，每組10只，即對照組和四個不同劑量D－半乳糖(50、100、200、500 mg/kg)腹腔注射建造的老年性聾模型組。對照組(甲組)腹腔注射等體積的生理鹽水作為對照，模型組(4種劑量分別為 MG1，MG2，MG3和MG4)每天一次，持續(xù)10周。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 興奮性實驗［1］:利用曠場實驗分析。觀察小鼠在5 min內(nèi)跨格次數(shù)、站立次數(shù)、排便粒數(shù)和小便的次數(shù)?？绺翊螖?shù)和扶墻站立次數(shù)反映興奮性，排便粒數(shù)和小便次數(shù)反映緊張反射情況。

1.2.2 ABR反應(yīng)閾檢測:美國intelligent hearing聽覺誘發(fā)電位系統(tǒng)進行測試。1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg行腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后在具有良好隔音室內(nèi)(環(huán)境溫度25℃ ±3℃)。耳塞置于外耳道內(nèi)。用針灸銀針作電極，將電極分別置入顱頂及雙側(cè)乳突皮下深達骨膜，顱頂為記錄電極，參考電極在測試耳乳突部，對側(cè)耳乳突部為接地電極。刺激參數(shù):刺激聲為時程100 s的方波脈沖短聲(click)，帶通濾波100～3000 Hz，掃描時程10 ms，掃描平均疊加1024次，增益10000倍，短聲刺激重復(fù)率為11次/s，刺激強度從90 dB開始，5 dB一檔次遞減，以Ⅲ波為標(biāo)志波確定閾值。再以80 dB的刺激強度測試大鼠的各波潛伏期和波間期。取每只大鼠右耳結(jié)果進行分析。

1.2.3 血清中的MDA和SOD檢測:各組動物在用藥前和用藥后分別采靜脈血2mL，室溫下靜置30 min，于4℃下3500 r/min離心10 min，取上層血清置－20℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)錅y。測試的過程嚴(yán)格按照測試盒上的說明進行操作。分別計算出SOD活力和MDA的濃度。

1.2.4 聽皮層石蠟切片:動物麻醉，開胸，經(jīng)左心室灌注生理鹽水，沖凈血液，隨后用4%多聚甲醛進行心臟灌注，然后開顱解剖定位并取下聽皮層，固定后石蠟包埋切片，每張切片的厚度為6 μm，進行甲苯胺藍染色。觀察其神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0等統(tǒng)計軟件對資料進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)值用(±s表示，五組之間進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 興奮性實驗測試結(jié)果

各實驗組較對照組其探究活動(爬格數(shù)和扶墻次數(shù))明顯減少(P＜0.05)，但其緊張度(大小便)無明顯變化(P ＞0.05)(表1)。

表1 D－半乳糖各不同劑量興奮性實驗各項指標(biāo)比較(n=10)Tab.1 Comparison of four excitatory experiment indexes in different groups(n=10)

2.2 血清中MDA和SOD檢測結(jié)果

MG1、MG2、MG3、MG4 四組 SOD 活性較甲組均有不同程度下降(P＜0.05)。其中 MG1、MG2、MG3三組之間差異不顯著 (P ＞0.05)。MG4組SOD活性最低，與其余各組相比均有顯著性差異(P ＜0.05)。MG1、MG2、MG3、MG4 四組 MDA 較CG組均有不同程度下降(P ＜0.05)。其中 MG1、MG2、MG3三組之間差異不顯著 (P ＞0.05)。MG4組MDA最高，與其余各組相比均有顯著性差異 (P＜0.05)(表2)。

表2 D－半乳糖各不同劑量組SOD(U/mgprot)活性和MDA(nmol/mgprot)的濃度比較(n=10)Tab.2 Comparison of the activity of SOD and the level of MDA in serum in different groups(n=10)

2.3 ABR檢測結(jié)果

MG1、MG2、MG3、MG4 四組 ABR 反應(yīng)閾、Ⅰ、Ⅲ波潛伏期和Ⅰ—Ⅲ波間期較CG組均有不同程度升高和延長，但其CG、MG1、MG2、MG3四組組間差異不顯著(P ＞0.05)，MG4組不僅ABR反應(yīng)閾明顯升高，且I、III波潛伏期和波間期較 CG、MG1、MG2、MG3各組差異均有顯著性差異 (P＜0.05)(表3)。

2.4 甲苯胺藍染色結(jié)果

光鏡下見 CG、MG1、MG2、MG3四組中大鼠聽皮層神經(jīng)細(xì)胞密集，染色均勻，尼氏體正常，胞核和胞質(zhì)極少有皺縮和空泡樣變。膠質(zhì)細(xì)胞正常。MG4組中聽皮層神經(jīng)元數(shù)明顯減少(P＜0.05)，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，胞核和胞質(zhì)濃縮，尼氏體減少(表4，圖1，見彩插3)。

表3 D－半乳糖各不同劑量組ABR檢測結(jié)果比較(n=10)Tab.3 Comparison of the results of ABR detection in different groups(n=10)

表4 D－半乳糖各不同劑量組聽皮層神經(jīng)元數(shù)比較(n=10)Tab.4 Comparison of the number of neurons in different groups(n=10)

3 討論

D－半乳糖致衰老模型是由中國學(xué)者［2］在 20世紀(jì)80年代末期建立并應(yīng)用于老年醫(yī)學(xué)研究的，該模型在建立的初期主要是用于老年性白內(nèi)障的研究，在后續(xù)的研究中越來越多的證據(jù)表明，D－半乳糖的致代謝紊亂作用不僅作用于眼晶體，其他部位如視網(wǎng)膜、肝、腦、耳等組織也會出現(xiàn)一系列的退行性改變。國內(nèi)已有學(xué)者提出以D－半乳糖誘導(dǎo)豚鼠發(fā)生衰老，可以在內(nèi)耳產(chǎn)生老年性聾的病理改變［3］。D－半乳糖在體內(nèi)可氧化產(chǎn)生大量自由基，使機體抗氧化酶活力下降，過氧化產(chǎn)物累積，還可以造成組織細(xì)胞內(nèi)半乳糖醇堆積，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙，代謝紊亂。還有研究發(fā)現(xiàn) D－半乳糖具有降低細(xì)胞增殖能力，加速細(xì)胞老化作用。最終加速機體衰老，并誘導(dǎo)體內(nèi)多器官發(fā)生衰老性疾?。?］。

老年性聾動物模型動物品種的選擇有豚鼠、SD大鼠、Wistar大鼠，給藥途徑有口服、眼球后、頸部皮下和腹腔注射給藥，給藥的時間有4周、6周、8周等。在動物品種方面，豚鼠的聽覺較 SD大鼠和Wistar大鼠敏感，常用于聽力學(xué)實驗方面的研究，但其飼養(yǎng)成本較高，并由于其聽覺的特殊性不宜普遍推廣。在給藥途徑方面，口服是將D－半乳糖混入飼料中每日定時定量喂養(yǎng)，這種方法過于理想化，對實驗條件的準(zhǔn)確度把握較差。眼球后注射操作方法較為復(fù)雜，并容易操成局部損傷，而皮下注射方法較為簡單，但易在局部形成腫塊不宜吸收。另外，傳統(tǒng)的造模方法所需時間只要4～6周，但本實驗在傳統(tǒng)劑量下(50 mg/kg～100 mg/kg)6周左右并未發(fā)現(xiàn)大鼠的聽力(ABR反應(yīng)閾，Ⅰ—Ⅲ波的潛伏期和波間期)有顯著性的變化。本實驗研究通過對Wistar大鼠在不同劑量D－半乳糖的連續(xù)腹腔注射10周后，觀察其是否符合老年性聾實驗動物模型。實驗前后所有大鼠并無因給藥而出現(xiàn)死亡、體重異常改變的現(xiàn)象。實驗組動物在6～8周時均出現(xiàn)行動遲緩、進食少、體形消瘦、反應(yīng)差等形體衰老現(xiàn)象。結(jié)合興奮性試驗結(jié)果分析可知，實驗組動物都出現(xiàn)不同程度的衰老變化，但ABR反應(yīng)閾在此期間并無明顯變化。10周后發(fā)現(xiàn)實驗組中僅500 mg/kg其他各組之間差異有顯著性組，出現(xiàn)聽力下降(P＜0.05)，并且其血清中的SOD活性和MDA的濃度較其他各實驗組之間差異有顯著性，而其他實驗組之間無顯著性差異。結(jié)果表明一段時間內(nèi)連續(xù)給藥可以使大鼠發(fā)生衰老變化，但衰老并不一定就有聽力下降的表現(xiàn)，這可能與給藥時間長短、給藥的劑量存在的關(guān)系。實驗證實 D－半乳糖500 mg/kg的劑量每日一次是可以被機體接受的，并可以產(chǎn)生顯著的聽力下降，是切實可行的造模方法。

老年性聾不僅表現(xiàn)為內(nèi)耳病理形態(tài)學(xué)改變，聽覺中樞神經(jīng)系統(tǒng)亦可發(fā)生退行性變，聽覺傳導(dǎo)通路和皮層中神經(jīng)核團內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞萎縮，數(shù)量減少，甚至發(fā)生核固縮［5］。本實驗在實驗組大鼠聽皮層觀察到其神經(jīng)元計數(shù)明顯少于對照組，并且其形態(tài)上也發(fā)生顯著改變，與文獻報道的檢測一致。有學(xué)者［6］在通過比較3月齡和36月齡大鼠發(fā)現(xiàn)老年大鼠的聽皮層的厚度較成年大鼠減少46%左右，且神經(jīng)元胞體，樹突的結(jié)構(gòu)和形態(tài)均有改變。在其他的一些研究中發(fā)現(xiàn)18月齡的Wistar大鼠較3月齡的聽皮層的細(xì)胞凋亡率顯著升高，從而造成聽皮層的功能減退而出現(xiàn)聽力下降［7］。D－半乳糖長期應(yīng)用可以使機體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基。氧自由基不僅能激活細(xì)胞凋亡基因，使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，而且能直接損傷 DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時還能影響核基因轉(zhuǎn)錄，改變細(xì)胞的表型特征，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。SOD則是體內(nèi)重要的自由基清除劑，是生物體防御活性氧和其他氧自由基傷害的酶［8］。有研究表明由D－半乳糖所造成大鼠氧化損傷的機制與自然衰老大鼠是相一致的，都是通過減低SOD基因轉(zhuǎn)錄水平從而導(dǎo)致 SOD蛋白表達水平降低［9］。另外，SOD還與某些凋亡基因有著密切關(guān)系。腫瘤壞死因子(TNF)可引起許多腫瘤或非腫瘤細(xì)胞的凋亡，TNF可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)表達的SOD能抑制它所引起的細(xì)胞凋亡，當(dāng)SOD水平下降時，細(xì)胞對TNF的敏感性升高，造成細(xì)胞的凋亡率上升［10］。在大鼠聽皮層、蝸核、耳蝸組織中氧自由基產(chǎn)生增多，同時機體抗氧化防御系統(tǒng)功能下降，產(chǎn)生與清除之間出現(xiàn)顯著失衡，發(fā)生氧化損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，聽覺系統(tǒng)細(xì)胞受到損害和減少，而導(dǎo)致聽覺功能障礙［11］。本實驗對 D－半乳糖建立老年性聾模型進行研究，為老年性聾的研究提供－個可靠、簡便易行的實驗動物模型。

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Model Establishment of Presbycusis by D-galactose

CHEN Shi－yan1，CHEN Xian－ming1，2，LUO Ping2，XIAO Li2
(1.Clinical Medicine School，F(xiàn)uzhou General Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350025，China;2.Department of Otolaryngology－Head and Neck Surgery，F(xiàn)uzhou General Hospital of PLA，F(xiàn)uzhou 350025，China)

Objective To find an ideal way for model establishment of presbycusis by D－galactose.Methods Fifty wistar rats were randomly divided into five groups，including one control group(CG)and four model groups(model group 1∶MG1，model group 2∶MG2，model group 3∶MG3 and model group 4∶MG4)with different dosages of D－galoctose(50 mg/kg，100 mg/kg，200 mg/kg，500 mg/kg).Then，we observed in each group the changes in animal behavior(excitatory experiment)，in ABR，and in the activity of SOD and the level of MDA in serum，as well as morphological and quantitative changes in auditory cortex neurons.Results Compared with the control group，no visible changes of tensity were observed，while the ability of exploration obviously decreased，and the activity of SOD and the level of MDA in serum significantly increased(P＜0.05)in the four model groups.However，only in MG4，latency of waveⅠ andⅢ and threshold of ABR were significantly delayed and elevated when compared with the control group.In addition，significant morphological changes in auditory cortex could also be seen in MG4，such as scarcely distributed neurons，swollen bodies of neurons，and reduced number of Niss＇s bodies.Conclusion It is an effective method for the model preparation of presbycusis by intraperitoneally injection of wistar rat by 500 mg/kg D－galactose every day for 10 weeks.

Wistar rat;Presbycusis;D－galactose;Model，animal

R764.436

A

1671－7856(2010)07－0017－04

2010－03－02

圖1 甲苯胺藍染色結(jié)果
Fig.1 Results of auditory cortex section stained by toluidine blue
注：a:對照組； b:模型組 2； c: 模型組 4。
Note: a: Control group; b: Model group 2; c: Model group 4.

福建省科技計劃重點項目(2009Y0041)。

陳十燕(1985－)，男，碩士生，研究方向:耳聾的基礎(chǔ)和臨床研究。E－mail:Chenshiyan0207@163.com

陳賢明。E－mail:fzchxming@sina.com