Feridex標記胎盤來源的間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞的實驗研究

陳 霞，尹曉娟

(1.中國人民解放軍第324醫(yī)院兒科，重慶 400020; 2.中國人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院八一兒童醫(yī)院，北京 100700)

間充質(zhì)干細胞是臨床研究最常用的細胞來源，在組織工程研究、創(chuàng)傷修復(fù)、疾病終末期治療等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，種子細胞的來源已成為國內(nèi)外學(xué)者探討的熱點。胎盤作為胚胎發(fā)育過程中維系母體和胎兒氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)交換的重要暫時性器官，主要由起源于細胞滋養(yǎng)層和胚外中胚層的胎兒叢密絨毛膜和母體子宮基蛻膜共同組成，被視為產(chǎn)后“廢棄物”，因而具有最佳的倫理學(xué)優(yōu)勢和應(yīng)用前景。筆者主要對胎盤來源的間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性和向神經(jīng)前體細胞分化的特點進行研究，并用菲立磁標記成功，期望下一步研究能將胎盤間充質(zhì)干細胞用于新生兒缺血缺氧性腦病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);CO2培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱(法國Jouan公司);流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司);6孔、24孔培養(yǎng)板(美國Corning公司);菲立磁(美國先進磁力公司)。低糖DMEM培養(yǎng)基(DMEM-LG，美國Gibco公司);胎牛血清(美國Hyclone公司);重組人堿性成纖維生長因子(bFGF)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，表皮生長因子(EGF)均為美國R＆D公司產(chǎn)品;淋巴細胞分離液(Ficoll，密度1.077 g/mL，上海試劑二廠);鼠抗人 CD14，CD34，CD105，CD73，單克隆抗體和Ⅳ型膠原酶，多聚左旋賴氨酸(PLL)均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 胎盤間充質(zhì)干細胞的分離

取足月剖宮產(chǎn)胎兒的胎盤(根據(jù)醫(yī)院規(guī)定并經(jīng)家屬同意)，剝離母體蛻膜面和胎兒面羊膜，取小塊胎兒的胎盤組織100 g，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3～5遍，剪成碎片，加入0.1%Ⅳ型膠原酶，37℃下消化60 min，見組織液渾濁后用4層紗布過濾。過濾后的懸液用胎牛血清中和，1 200 r/min離心10 min后，再以500 r/min離心5 min。去除上清液，加入完全培養(yǎng)基[含低糖DMEM，10%胎牛血清(FBS)，100 U/mL青、鏈霉素]，置37℃及5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3～4 d進行換液，待細胞90%鋪滿培養(yǎng)瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化，3～5 d傳代1次。

1.2.2 間充質(zhì)干細胞的表面分子鑒定

將長滿90%的細胞去掉培養(yǎng)液后，加入2.5 g/L胰酶消化，形成的細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，去除上清液，加入全培養(yǎng)基 2 mL重懸細胞，調(diào)整細胞密度為 4×105個/mL。加入 CD34，CD45，CD73，CD105一抗，室溫、避光反應(yīng) 1 h，上流式細胞儀檢測。

1.2.3 間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)前體細胞分化

制作細胞爬片，加入6孔板中，取第3代胎盤來源的間充質(zhì)干細胞種于爬片上，以DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞長至鋪滿70% ～80%玻片時，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，換10 ng/mL EGF+10 ng/mL bFGF+DMEM/F12，并分別添加相應(yīng)濃度的血清，預(yù)誘導(dǎo)3 d后，吸去培養(yǎng)液，洗凈后加入DMEM/F12+0.1 μmol/L全反式維甲酸(RA)、10 ng/mL GDNF+10 ng/mL BDNF進行正式誘導(dǎo)，并添加相應(yīng)濃度的血清，每6～8 h于倒置顯微鏡下觀察細胞。

1.2.4 Feridex標記神經(jīng)前體細胞

用含15%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液稀釋Feridex至25mg/L，加入PLL(最終質(zhì)量濃度為0.75 mg/L)37℃孵育1 h。將分化的神經(jīng)前體細胞調(diào)整細胞密度為2×106/mL，移入細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，12 h后提取細胞離心，細胞沉淀用PBS洗滌3次，更換無鐵的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，細胞提取行普魯士藍染色鑒定所分化細胞及常規(guī)ABC法進行抗Nestin免疫組織化學(xué)染色，DAB-H2O2棕色法呈色，顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

初接種的細胞種類較多，大部分呈圓形。接種24 h后可見部分圓形單核細胞貼壁。原代培養(yǎng)36～48 h后貼壁的單核細胞開始增多，但仍保留圓形。72 h后細胞開始增殖迅速并出現(xiàn)多種形態(tài)。大多數(shù)細胞呈梭形并帶有2～3個長的突起;細胞核較大，扁圓形，可見1～2個核仁。少部分細胞呈不規(guī)則形，形態(tài)多樣，胞體大;胞核為圓形或橢圓形，有多個核仁;胞漿可向不同方向伸出突起;細胞集落間相互融合成單層，排列具有一定方向性。細胞倍增時間7～10 d。反復(fù)換液和傳代培養(yǎng)去除非貼壁細胞，至第3代的PMSCs形態(tài)基本單一，為梭形或扁平形，增殖至細胞融合時，倒置相差顯微鏡下觀察呈漩渦狀排列(圖1)。流式細胞儀鑒定表面分子標志見圖2。PMSCs經(jīng)誘導(dǎo)3 d后可見轉(zhuǎn)化的細胞增殖分裂成小圓形，呈團簇狀半懸浮狀態(tài)。對這些細胞進行連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)其胞體逐漸增大，并有突起逐漸伸出、延長，誘導(dǎo)7 d后可見大量具有2個或多個突起的細胞，胞體呈大多角形或不規(guī)則形，類似于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞形態(tài)，折光性較強，細胞突起間相互連接成網(wǎng)狀，具有典型的神經(jīng)元細胞樣形態(tài)。Feridex標記分化的神經(jīng)干細胞見圖3。

圖1 PMSCs培養(yǎng)至3代，細胞呈漩渦狀排列40×1

圖2 流式細胞儀鑒定表面分子標志圖

3 討論

圖3 Feridex標記分化的神經(jīng)干細胞圖

人類的胎盤在胚胎發(fā)育、營養(yǎng)、免疫耐受過程中不僅扮演了基礎(chǔ)和重要的角色，而且含有大量的祖/干細胞[1]。一個成熟的胎盤直徑15～20 cm，厚度2～3 cm，一般分為羊膜上皮、羊膜間質(zhì)、絨毛滋養(yǎng)層、絨毛間質(zhì)4個部分，從這些部分可以分離人羊膜上皮細胞、人羊膜間充質(zhì)干細胞、人絨毛間充質(zhì)干細胞、人絨毛滋養(yǎng)層細胞[2]。研究表明，人羊膜和絨毛間充質(zhì)干細胞具有自我更新能力，呈成纖維細胞樣克隆生長，表達特殊的表面抗原，具有多向分化能力以及為胚胎來源[3-4]。國外報道，將胎盤來源的間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，取得了良好效果[5-6]。它與骨髓來源的間充質(zhì)干細胞比較具有以下優(yōu)點:在來源方面，胎盤是產(chǎn)后“廢棄”組織，來源廣泛、取材方便，且滿足倫理學(xué)要求。成體組織如骨髓、脂肪組織、外周血都必須通過穿刺獲得，不僅對供者造成創(chuàng)傷，還會增加受污染的概率，同時也無法大量獲取。骨髓組織中間充質(zhì)干細胞的含量極低，這也是骨髓來源的間充質(zhì)干細胞的一個缺點，而且供者年齡在一定程度上也限制了骨髓來源的間充質(zhì)干細胞的進一步應(yīng)用，而胎盤作為產(chǎn)后組織則可避免年齡的影響。此外，胎盤組織如臍帶和臍帶血可以低溫保存，可用于建立細胞庫，而骨髓卻很難實現(xiàn)[7]。

本研究應(yīng)用膠原酶消化法從胎盤中獲得了呈成纖維樣漩渦樣生長的細胞，間充質(zhì)干細胞的標志物表達陽性(CD105，CD73)，間充質(zhì)干細胞標志物表達陰性(CD34，CD14)。用10 ng/mL EGF+10 ng/mL bFGF+DMEM/F12預(yù)誘導(dǎo)后，改為 DMEM/F12+0.1 μmol/L RA，10 ng/mL GDNF+10 ng/mL BDNF正式誘導(dǎo)，7 d后細胞分化成類似于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞形態(tài)。將終質(zhì)量濃度為0.75 mg/L的Feridex標記分化的細胞，普魯士藍顯示90%以上的干細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)細小的藍色鐵顆粒，倒差顯微鏡下觀察顯示nestin陽性，證實誘導(dǎo)分化成功。本研究成功地將胎盤來源的間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細胞，希望在下一步的研究中能應(yīng)用于兒童不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如缺血缺氧性腦病。

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