表沒食子兒茶素沒食子酸酯對局灶性腦缺血－再灌注損傷的影響

段秀君

(河南省鶴壁市食品藥品檢驗所，河南 鶴壁 458030)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)屬于茶多酚中黃烷醇類，其基本結(jié)構(gòu)為2-鄰苯酚基苯并吡喃衍生物，具有很強的清除自由基、抗氧化功效[1-3]。關(guān)于EGCG是否能改善腦缺血-再灌注損傷時腦組織代謝障礙，尚未見報道。筆者采用線栓法建立大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血-再灌注損傷模型，并進行神經(jīng)功能行為學(xué)評分、腦組織乳酸含量及能量代謝酶活性測定，旨在探討EGCG對腦缺血-再灌注損傷的預(yù)防作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試藥、動物及儀器

藥品與材料:EGCG(美國sigma公司，批號為E4143);乳酸檢測試劑盒、三磷酸腺苷(ATP)酶檢測試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。雄性SD大鼠，體重270～330 g，河南省實驗動物中心提供，動物合格證號為410175。722型紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.2 實驗設(shè)計

采用線栓致可逆性大鼠大腦中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion，MCAO)方法造成局灶性腦缺血-再灌注損傷模型。選用雄性SD大鼠80只，隨機分成5組，每組16只，即假手術(shù)組、缺血-再灌注模型組(I/R)、EGCG高劑量組(100 mg/kg)、EGCG中劑量組(50 mg/kg)、EGCG低劑量組(25 mg/kg)。術(shù)前60 min采用腹腔給藥的方式，注射不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EGCG溶液，假手術(shù)組和模型組則分別給予等量的生理鹽水。

1.3 模型建立

用10%水合氯醛麻醉(300 mg/kg)大鼠，分離暴露出左側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)和翼腭動脈(Pterygopalatine artery，PPA)和迷走神經(jīng)。依次游離并電凝右ECA的所有分支，結(jié)扎ECA的主干。分離ICA至顱底，在PPA的起始處結(jié)扎PPA，僅保留ICA入顱主干。將預(yù)先準(zhǔn)備好的尼龍線(尼龍線頭端燒成光滑的線拴，直徑約為0.25 mm)經(jīng)ECA主干的切口插入到大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)的起始處，大約離頸內(nèi)、頸外靜脈分叉處約18 mm，感到阻力時，即完成一側(cè)MCA阻塞?？p合切口，將尼龍線的尾端留在皮外，再灌注時將尼龍線輕輕外抽，感到阻力時，意味著尼龍線的頭端已回到ECA的主干中，從而實現(xiàn)MCA的再灌注。假手術(shù)組只進行麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎血管及導(dǎo)入線栓。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

神經(jīng)功能缺損評分:腦缺血1 h、再灌注24 h后，采用Longa等[4]的神經(jīng)功能學(xué)評分法檢測動物神經(jīng)損傷程度。肢體活動正常記為0分;梗死對側(cè)前爪內(nèi)收、不能伸直記為1分;向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈者記為2分;自主運動時向偏癱側(cè)傾倒記為3分;無自主活動，并伴意識障礙記為4分。

腦組織含水量測定:進行神經(jīng)功能評分后，將大鼠斷頭處死，取出右側(cè)腦組織，用濾紙吸干表面水份，立即于電子天平稱重(濕質(zhì)量)，120℃恒溫烘烤24 h至恒重后再次稱重(干質(zhì)量)，采用干濕質(zhì)量法測定腦組織含水量，按Ellis公式[5]計算腦組織含水量。腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

腦組織勻漿制備:將大鼠按時斷頭，取右側(cè)腦組織，稱取腦組織塊約0.5 g，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗組織表面的血液，濾紙吸干，再次稱重，置電動玻璃勻漿器中，加入預(yù)冷的生理鹽水制成腦組織勻漿，再以4℃低溫、3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，貯存于-20℃冰箱保存，備用。

生化指標(biāo)測定:按照試劑盒說明，以比色法測定乳酸的含量和Na+-K+-ATP酶的活性，以考馬斯亮藍法測定蛋白的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

結(jié)果見表1?？梢姶笫竽X缺血1 h再灌注24 h后，模型組神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量及腦組織乳酸含量明顯升高，腦組織Na+-K+-ATP酶活性明顯降低，與假手術(shù)組比較，差異具有顯著性(P＜0.05);EGCG各劑量組神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量及腦組織乳酸含量明顯降低，腦組織Na+-K+-ATP酶活性明顯升高，與模型組比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。

表1 EGCG對大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能評分及腦組織含水量的影響(X ±s，n=8)

3 討論

EGCG的脂溶性高，能有效通過血腦屏障[6]，清除自由基，降低脂質(zhì)過氧化[7-8]，從而具有神經(jīng)保護作用。

由于腦的能量代謝具有對氧的需求量大、靠血液轉(zhuǎn)運葡萄糖供能、沒有糖原及ATP的儲備等特性，所以當(dāng)腦缺血時腦組織必須采用無氧酵解的方式代謝葡萄糖獲得能量，而無氧酵解途徑的能量產(chǎn)生有限，會出現(xiàn)能量耗竭，神經(jīng)元處于能量低下狀態(tài)，引起進一步繼發(fā)病理狀態(tài)，從而引起神經(jīng)元的損傷和死亡[9]。在氧供不足的情況下，糖代謝產(chǎn)生的丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下生成乳酸，因此乳酸的水平反映了組織無氧酵解的程度。而腦組織中乳酸的蓄積也會進一步引起神經(jīng)元的損傷，造成惡性循環(huán)。由于ATP酶直接以ATP為底物，其活性直接受到組織ATP水平的影響。腦缺血后ATP生成減少以及缺氧可導(dǎo)致缺血酸中毒，腦組織內(nèi)酸性代謝產(chǎn)物增多，使得ATP酶活性降低，因此ATP酶活性可以反映細胞的能量水平。腦缺血-再灌注損傷后，能量耗竭，ATP產(chǎn)生不足，Na+-K+-ATP酶活性下降，導(dǎo)致細胞內(nèi)Na+濃度增高引起細胞毒性腦水腫而影響細胞功能[10]，從而造成神經(jīng)損傷。缺血-再灌注組大鼠的腦組織乳酸水平顯著升高，ATP酶活性顯著下降，這兩方面的結(jié)果共同反映了缺血-再灌注損傷大鼠腦組織神經(jīng)元氧供不足，能量代謝障礙。

本研究結(jié)果表明，EGCG能明顯降低大鼠大腦中動脈缺血-再灌注損傷腦組織含水量和乳酸的生成，提高缺血腦組織的ATP酶活性，改善能量代謝障礙的狀況，增加腦組織能量供應(yīng)，減輕因能量耗竭引起的神經(jīng)系統(tǒng)損害，從而對腦神經(jīng)起到保護作用。

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