不同成熟期梔子果實(shí)有效成分累積的研究

何國(guó)振,周 妹,湯麗云,馬力敏,徐鴻華

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,廣州 510006;2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣州 510642

不同成熟期梔子果實(shí)有效成分累積的研究

何國(guó)振1＊,周 妹1,湯麗云2,馬力敏1,徐鴻華1

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,廣州 510006;2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣州 510642

根據(jù)果實(shí)顏色可以將梔子成熟期劃分為全青期、2/3青 1/3黃期、半青半黃期、1/3青 2/3黃期、全黃期、枯黃期。采用 HPLC法測(cè)定梔子果實(shí)在不同成熟時(shí)期 3種主要有效成分梔子苷、綠原酸、西紅花苷-1的含量。結(jié)果表明:梔子苷、綠原酸、西紅花苷-1含量均出現(xiàn)兩個(gè)高峰期,峰形陡峭;高峰出現(xiàn)的時(shí)期不完全一致。梔子苷的含量在全青期和 1/3青 2/3黃期最高,而西紅花苷-1的含量在全青期和全黃期最高。全青期為梔子苷和西紅花苷-1的最佳采收期。根據(jù)果實(shí)顏色及時(shí)采收才能獲得高含量的目標(biāo)活性成分。

梔子苷;綠原酸;西紅花苷-1;最佳采收期;含量測(cè)定

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasm inoidesEllis的干燥成熟果實(shí),具有瀉火除煩,清熱利尿,涼血解毒等功效[1]?；瘜W(xué)成分研究表明,梔子中含有 3類主要有效成分,即環(huán)烯醚萜苷類,有機(jī)酸類和色素類。梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1分別為 3類成分的主要物質(zhì)[2]。為了獲得高含量梔子有效成分,近年來人們研究了不同采收期對(duì)梔子苷含量的影響[3,4],認(rèn)為不同采收期梔子中梔子苷、熊果酸的含量有顯著變化,并各自對(duì)合理采收期提出了不同的建議。梔子質(zhì)量的優(yōu)劣應(yīng)是多種成分的綜合表現(xiàn)。從梔子果實(shí)的不同發(fā)育期研究其主要藥效成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,對(duì)控制梔子的質(zhì)量具有重要意義。

梔子果實(shí)的體積達(dá)到最大后,進(jìn)入成熟期。整個(gè)成熟期的梔子果實(shí)顏色經(jīng)歷全青到枯黃的變化。本文以梔子果實(shí)不同顏色細(xì)分其成熟期,測(cè)定果實(shí)中梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1等 3種成分的含量,探索這些成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,為科學(xué)確定梔子的采收期、獲得高含量有效成分梔子作參考。本研究未見報(bào)道。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC2000高效液相色譜輸液泵;L2030紫外檢測(cè)器;L2200自動(dòng)進(jìn)樣器;T2000P色譜工作站 (上海天美科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑

梔子苷,綠原酸和西紅花苷-1對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)分別為 110749-200613, 110753-200413,111588-200501。乙腈為色譜純(Merck,Ger many),其余試劑均為分析純。

1.3 樣品

不同顏色的梔子果實(shí)于 2008年 10月 21日采自廣東省梅州市平遠(yuǎn)縣黃花陂梔子 GAP基地。在約 120株植株上隨機(jī)采集各顏色果實(shí),混合后按顏色分成 6組,即:全青 (1)、2/3青 1/3黃 (2)、半青半黃 (3)、1/3青 2/3黃 (4)、全黃 (5)、枯黃 (6)(見彩圖)。原植物經(jīng)作者鑒定為茜草科植物梔子Gardenia jasm inoidesEllis。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 PhenomenexLuna C18(25 mm×4.6 mm, 5μm),SecurityGuard Analytical(KJ0-4282)。梔子苷:流動(dòng)相乙腈-水(15∶85),檢測(cè)波長(zhǎng) 238 nm,流速1.0 mL/min;綠原酸:流動(dòng)相乙腈-0.4%磷酸 (13∶87),檢測(cè)波長(zhǎng) 327 nm,流速 0.8 mL/min;西紅花苷-1∶流動(dòng)相乙腈-水 (23∶77),檢測(cè)波長(zhǎng) 440 nm,流速1.0 mL/min。柱溫均為室溫。對(duì)照品及樣品的分離情況見圖 1～3。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1對(duì)照品適量,于容量瓶中分別加入甲醇、70%甲醇和 50%甲醇制成含梔子苷 0.202 mg/mL、綠原酸 0.03384 mg/ mL和西紅花苷-1 0.0654 mg/mL的對(duì)照品溶液。

圖 1 梔子苷對(duì)照品和梔子樣品HPLC圖譜Fig.1 Typical HPLC chromatograms of authentic geniposide and the extract ofGardenia jasm inoidesEllis.

2.3 供試品溶液的制備

梔子經(jīng)干燥后粉碎,過四號(hào)篩,得梔子粉末。

2.3.1 梔子苷樣品溶液的制備

精密稱取梔子粉末 0.1 g,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇 25.0 mL,加塞,稱重。超聲處理 20 min,冷卻,再稱重。用甲醇補(bǔ)足失重,搖勻。進(jìn)樣前用0.45μm微孔濾膜過濾。

2.3.2 綠原酸樣品溶液的制備

精密稱取梔子粉末 0.5 g,置于具塞錐形瓶中,加入 70%甲醇 25.0 mL,加塞,稱重。超聲處理 20 min,冷卻,再稱重。用 70%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻。進(jìn)樣前用 0.45μm微孔濾膜過濾。

2.3.3 西紅花苷-1樣品溶液的制備

精密稱取梔子粉末 0.1 g,置于具塞錐形瓶中,加入 50%甲醇 25.0 mL,加塞,稱重。超聲處理 40 min,冷卻,再稱重。用 50%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻。進(jìn)樣前用 0.45μm微孔濾膜過濾。

2.4 線性范圍考察

精密吸取梔子苷對(duì)照品溶液 1、3、7、10、20μL,綠原酸對(duì)照品溶液 1、5、10、15、20μL,西紅花苷-1對(duì)照品溶液 1、3、7、10、20μL,進(jìn)樣,測(cè)定色譜峰面積,以進(jìn)樣量(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸,回歸方程如表 1。

表 1 3種活性化合物的回歸曲線(n=5)Table 1 Calibration curve for the three active compounds(n=5)

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述各對(duì)照品溶液 10μL,連續(xù)進(jìn)樣 6次,以各成分峰面積計(jì)算 RSD,所得結(jié)果:梔子苷0.47%,綠原酸 2.47%,西紅花苷-1 1.95%。結(jié)果表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取上述各對(duì)照品溶液 10μL,按 0、2、4、8、12 h分別進(jìn)樣分析,測(cè)定峰面積值。三種成分的結(jié)果分別為:梔子苷 RSD 1.57%、綠原酸 RSD 1.50%、西紅花苷-1 RSD 1.81%。表明梔子苷,綠原酸和西紅花苷-1在 12 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批梔子藥材 18份,精密稱定,照供試品溶液制備方法制備,分別取 10μL進(jìn)樣分析,測(cè)定梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1含量,梔子苷 RSD為1.85%,綠原酸 RSD為 2.17%,西紅花苷-1 RSD為1.56%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的供試品定量,分別精密加入梔子苷、綠原酸及西紅花苷-1對(duì)照品溶液適量,按供試品溶液制備方法分別處理,同法測(cè)定含量,計(jì)算得梔子苷平均回收率為 101.44%,RSD為 1.16 %;綠原酸平均回收率為 99.87%,RSD為 2.77%;西紅花苷-1平均回收率為 101.02%,RSD為 2.01 %。測(cè)定結(jié)果見表 2。

表 2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=5 or 6)Table 2 Results of recovery test(n=5 or 6)

0.2504 0.1066 0.1040 0.2116 100.95西紅花苷-1 Crocin 1 0.0499 0.6198 0.6240 1.2433 99.92 101.02 2.01 0.0503 0.6248 0.6240 1.2676 103.02 0.0501 0.6223 0.6240 1.2672 103.35 0.0500 0.6211 0.6240 1.2573 101.95 0.0508 0.631 0.6240 1.2451 98.42 0.0503 0.6248 0.6240 1.2456 99.49

2.9 樣品測(cè)定

取不同顏色梔子果實(shí)干燥粉末(過四號(hào)篩)各 3份,精密稱定,按 2.3項(xiàng)下方法制備各供試品溶液,分別精密吸取各供試品溶液 10μL進(jìn)樣,測(cè)定結(jié)果見圖 4～7。

3 討論

3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)考察了超聲、回流處理對(duì)綠原酸和西紅花苷-1提純效果的影響,2種成分 2種提取方法提取率均相當(dāng),但超聲提取法操作更簡(jiǎn)便,因此采用超聲提取樣品;提取溶劑考察結(jié)果顯示 70%甲醇對(duì)綠原酸的提取率最高,而 50%甲醇對(duì)西紅花苷-1的提取率最高;提取時(shí)間考察結(jié)果顯示 20 min對(duì)綠原酸提取完全,對(duì)西紅花苷-1則是 40 min;考察冰浴與室溫對(duì)西紅花苷-1的提取效果,結(jié)果顯示室溫提取率較高且操作簡(jiǎn)便,因此采用室溫提取。

3.2 文中建立的各色譜方法適用于各成分的測(cè)定,由圖 1,2,3可以看出供試品中各組分與其他組分均達(dá)到基線分離,且基線平穩(wěn)。雖然現(xiàn)有很多文獻(xiàn)[5]采用DAD檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定梔子中多種成分,但是每種成分分別在最佳提取及分離條件下測(cè)定而得到的含量應(yīng)該更準(zhǔn)確。

3.3 圖 4的結(jié)果表明,梔子苷在梔子果實(shí)成熟過程中出現(xiàn)兩個(gè)含量高峰,一個(gè)高峰出現(xiàn)在果實(shí)達(dá)到最大體積、顏色為青色時(shí);另一個(gè)高峰出現(xiàn)在果實(shí)完全成熟之前,即顏色為 1/3青 2/3黃時(shí);因而梔子苷的累積規(guī)律表現(xiàn)為“高-低-高-低”的趨勢(shì)。付小梅等[3]也認(rèn)為梔子苷在果實(shí)發(fā)育期有兩個(gè)高峰。綠原酸在整個(gè)梔子果實(shí)成熟過程中,也有兩個(gè)含量高峰,第一個(gè)較小,第二個(gè)出現(xiàn)在果實(shí)完全成熟之前,與梔子苷的第二個(gè)高峰重疊(圖 5)。西紅花苷 -1與梔子苷的累積規(guī)律相似,同樣有兩個(gè)含量高峰,第一個(gè)高峰與梔子苷的第一個(gè)高峰重疊,但第二個(gè)高峰出現(xiàn)在果實(shí)完全成熟、即果實(shí)顏色為全黃色時(shí)(圖 6)。同時(shí)比較三種活性成分的累積規(guī)律 (圖7),可以看出,綠原酸在三種活性成分中的相對(duì)含量最低,梔子苷的相對(duì)含量最高。三種成分的累積高峰都比較陡峭。

圖7 不同發(fā)育時(shí)期梔子果實(shí)中三種有效成分的含量變化Fig.7 Dynamic variation of the content of three active compounds from the fruits ofGardenia jasm inoidesin different ripening stages

本研究是以果實(shí)的顏色來劃分梔子果實(shí)發(fā)育過程,并同時(shí)考察梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1等三種活性成分的累積規(guī)律。以顏色劃分果實(shí)發(fā)育過程并考察活性成分含量,比考察不同采收期僅梔子苷的含量要更能全面、準(zhǔn)確反映活性成分的累積規(guī)律。

詳細(xì)研究梔子活性成分在果實(shí)發(fā)育過程中的累積規(guī)律,可以為梔子的采收提供更加科學(xué)的依據(jù)。藥典僅規(guī)定了梔子苷的含量作為有效成分的指標(biāo),因此在全青期和 1/3青 2/3黃期都可以采收。由于西紅花苷的抗氧化作用的發(fā)現(xiàn)[6],該類化合物的藥理作用越來越受到重視。根據(jù)西紅花苷-1的累積規(guī)律,如果需要獲得西紅花苷-1高含量的果實(shí),則應(yīng)在梔子全青或全黃期采收。

由于三種活性成分的累積高峰都表現(xiàn)得比較陡峭,因而根據(jù)每一個(gè)果實(shí)的顏色來適時(shí)采收,才能獲得最高含量的目標(biāo)活性成分。

致謝:廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 2005級(jí)學(xué)生林詩東和譚宏韜協(xié)助采集本研究的材料。

圖 8 不同發(fā)育時(shí)期的梔子果實(shí)Fig.8 Fruits ofGardenia jasm inoidesin different developing stages

1 Ch P(中國(guó)藥典).Beijing:Chemistry Industry Press,2005. 173.

2 Xu J(徐娟),Tu BK(涂炳坤),Deng XZ(鄧先珍),et al. Advances on development and utilization of compositions withinGardenia jasm inoides.Hubei Forestry Sci Tech(湖北林業(yè)科技),2005,136:42-43.

3 Fu XM(付小梅),Chu XL(褚小蘭),Fan JS(范佳生),et al.Content analysis on gardenoside in grown and ungrown fruits of gardenia from different habitats.J ChinM edM at(中藥材),2000,23:754.

4 Zhao J(趙靜),You GJ(游國(guó)鈞),Li H(李輝).Deter mination of jas minoidin in gardenia at different culling period.Guiding J TCM(中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)),2007,13(7):102.

5 HeML,Cheng XW,Chen JK.Simultaneous deter mination of five major biologically active ingredients in different parts ofGardenia jasm inoidesfruits byHPLC withDiode-Array detection.Chrom atographia,2006,64:713.

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Studies on the Accumulation ofMajor Active Compounds from Gardenia jasm inoidesFruits in D ifferent Ripen ing Stages

HE Guo-zhen1＊,ZHOU Mei1,TANGLi-yun2,MA Li-min1,XU Hong-hua1

1College of Traditional ChineseM edicine,Guangzhou University of ChineseM edicine,Guangzhou 510006,China;2College of L ife Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China

According to the color,the whole ripening stage of gardenia(Gardenia jasm inoidesEllis)fruit can be divided into stages of cyan,2/3 cyan and 1/3 yellow,half of cyan and yellow,1/3 cyan and 2/3 yellow,yellow and scorch.The contents of three major bioactive compounds of geniposide,chlorogenic acid and crocin-1 were determined by HPLC method.The result shows that two accumulation peaks of each bioactive compound appeared during ripening stage.The shapes of all the peakswere sharp.And the stageswhich peaks appeared were not exact the same.The peaks of geniposide appeared at cyan stage and stage of 1/3 cyan and 2/3 yellow,whereas the peaks of crocin-1 appeared at cyan and yellow stages.The best harvesting time should be decided by colorof each fruit,and cyan stage should be the t ime for geniposide and crocin-1.To obtain higher content of target bioactive compound,fruits should be collected in t ime.

geniposide;chlorogenic acid;crocin-1;best harvesting stage;content deter mination

R284.1;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0678-05

2009-06-15 接受日期:2009-09-08

廣東省重大科技專項(xiàng) (2007A032200001);廣州市科技攻關(guān)重大項(xiàng)目(2007Z1-E5035)

＊通訊作者 Tel:86-20-39358553;E-mail:heguozhen@yahoo.com