沙棘茶水溶性多糖抗氧化活性的研究

李芳亮,王 銳,張紅梅

遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院,阜新 123000

沙棘茶水溶性多糖抗氧化活性的研究

李芳亮＊,王 銳,張紅梅

遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院,阜新 123000

通過還原力、清除超氧陰離子自由基、清除羥自由基和抑制 H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血實(shí)驗(yàn)來評價(jià)沙棘茶水溶性多糖(WPHT)體外抗氧化能力,并與 Vc進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,WPHT具有較強(qiáng)的還原能力,對 O-·2和·OH具有較強(qiáng)的清除作用,IC50分別為:394μg/mL、182μg/mL;對 H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血及MDA生成有很強(qiáng)的抑制作用,IC50分別為:221μg/mL、202μg/mL。說明WPHT在一定濃度范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

還原力;沙棘茶;多糖;抗氧化;紅細(xì)胞溶血

沙棘 (Hippophae Rham noidesL.)胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬的灌木或小喬木。沙棘的地理分布很廣,在東經(jīng) 2°～115°北緯 27°～68.5°之間,跨歐亞兩洲溫帶地區(qū),分為 6個(gè)種和 12個(gè)亞種,我國是沙棘資源最豐富的國家,主產(chǎn)于西南、西北等地,。作為藥物,沙棘具有止咳祛痰,消食化滯,活血散瘀等功效,同時(shí)沙棘也是廣大西部地區(qū)生態(tài)治理的優(yōu)選植物[1]。近年來,關(guān)于氧自由基的生理功能和毒性,以及清除自由基的抗氧化劑的研究普遍受到人們的關(guān)注[2-4],目前使用的抗氧化劑有維生素C、維生素 E、茶多酚、大豆異黃酮、BHT、BHA、甘露醇和甘草浸膏等;合成抗氧化劑有潛在毒副作用,尋找安全、高效的天然抗氧化劑已成為研究的熱點(diǎn)之一。

目前對沙棘油和沙棘黃酮研究的比較多[5],而沙棘茶水溶性多糖抗氧化性能的研究未見報(bào)道,本文以維生素 C作為對照對沙棘茶水溶性多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究,為開發(fā)新的功能性食品和天然抗氧化劑,更合理利用沙棘資源提供參考。

1 材料與儀器

沙棘茶 (阜新沙棘產(chǎn)品總經(jīng)銷),昆明種小鼠,雄性,體重為 25±2 g(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);木瓜蛋白酶(Sigma),MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所),Vc等試劑均為國產(chǎn)分析純;UV23150型紫外可見近紅外分光光度計(jì) (日本島津),KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 WPHT的制備

取 100 g沙棘茶,粉碎,加入 2 000 mL蒸餾水,

于 80℃水浴中浸提 2 h,提取 3次,過濾后合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至 200 mL,采用木瓜蛋白酶-sevag法聯(lián)合去蛋白,透析后,濃縮至 100 mL,加入無水乙醇使其終濃度為 80%,離心,所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚分別離心洗滌 3次,沉淀真空干燥后得沙棘茶水溶性多糖 (WPHT)。取 1 g沙棘茶多糖重新溶解于 100 mL蒸餾水中,稀釋 10倍后備用,用硫酸蒽酮法[6],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品測得其多糖含量為 80%。

2.2 還原力實(shí)驗(yàn)-普魯士蘭法[7]

式中A空白表示未加WPHT鄰苯三酚自氧化速率;A樣品表示加入WPHT后鄰苯三酚自氧化速率。

2.4 WPHT對·OH清除率的測定-Smirnoff等的改良法[8]

式中A空白表示未加WPHT的吸光度值;A樣品表示加入WPHT后吸光度值。

2.5 WPHT對 H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶(MEH)血抑制率的測定[9]

將小鼠斷頭取血,肝素鈉抗凝,離心得紅細(xì)胞,冷生理鹽水離心洗滌 3次,制成 0.5%紅細(xì)胞懸浮液。取紅細(xì)胞懸浮液 3.0 mL與1.0 mL不同濃度的WPHT溶液混合,再加入 0.2 mL 1 mol/L H2O2于37℃孵育 1 h。其中,基礎(chǔ)對照組不加WPHT、不加H2O2,用生理鹽水補(bǔ)到 4.2 mL;空白對照組不加WPHT,加 0.2 mL 1 mol/L H2O2,用生理鹽水補(bǔ)到4.2 mL。然后 3000 r/min離心 10 min取上清液,于540 nm處吸光度值。并取上清液 3 mL溶液,按試劑盒說明書的測定方法測定其MDA含量為 X。

3 結(jié)果與討論

3.1 還原力測定

物質(zhì)的抗氧化作用是通過自身的還原作用給出電子使自由基變成穩(wěn)定的分子,從而失去活性;還原力越大,抗氧化能力就越強(qiáng)。因此可通過測定還原力來說明抗氧化活性的強(qiáng)弱。本文是以普魯士藍(lán)產(chǎn)生量作為指標(biāo),在 700 nm處比色,由吸光值變化來檢測還原力大小,吸光值越大表示樣品的還原力越強(qiáng)。

WPHT和Vc的還原力測定結(jié)果見圖 1,由圖 1可以看出隨著 Vc和WPHT濃度增加,吸光度值逐漸增加,還原力逐漸增強(qiáng);在 10～600μg/mL范圍內(nèi),WPHT和Vc還原力表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。同濃度Vc的還原力要略大于沙棘茶水溶性多糖。

3.3 WPHT對·OH清除作用

H2O2與 Fe2+混合產(chǎn)生·OH,在反應(yīng)體系中加入水楊酸,它能有效地捕捉·OH,從而生成 2,3-二羥基苯甲酸,該產(chǎn)物在 510 nm處有強(qiáng)吸收,若有抗氧化物質(zhì)加入,便會(huì)與水楊酸競爭,從而使有色產(chǎn)物的生成量減少。因此在 510 nm處比色,可以評價(jià)受試物清除·OH的能力。

WPHT和Vc對清除·OH效果見圖 3,由此圖可知,WPHT和Vc在 10～600μg/mL范圍內(nèi),清除·OH自由基有較好的量效關(guān)系。二者都隨濃度的增加,對·OH的清除率增強(qiáng)。但WPHT在大于 400 μg/mL時(shí),隨濃度的增加,其清除率增加有變緩的趨勢。使用 Microcal Origin軟件對曲線進(jìn)行擬合WPHT的 IC50為 182μg/mL;Vc的 IC50為 317μg/ mL,所以在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下,WPHT清除的能力顯著高于同濃度的 Vc,好于香菇多糖[10]、大球蓋多糖、海帶硫酸多糖和繁枝蜈蚣藻多糖等植物多糖[12～14]和沙棘黃酮[12];同濃度 WPHT對清除率比清除·OH的小,這可能因?yàn)槎嗵翘兼溕系臍湓涌梢耘c·OH結(jié)合成水,達(dá)到清除·OH的目的,對于而言,多糖可與其發(fā)生氧化反應(yīng),達(dá)到清除的目的[15]。

3.4 WPHT對 H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血(MEH)的影響

臨床已發(fā)現(xiàn),紅細(xì)胞膜的氧化損傷是溶血的重要原因。H2O2可以于紅細(xì)胞內(nèi)的 Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生· OH,造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生MDA,膜的流動(dòng)性下降,通透性增加,從而造成膜內(nèi)外物質(zhì)的外泄和內(nèi)流,膜形成“小孔”,細(xì)胞破裂,發(fā)生溶血[16]。亞血紅素被氧化成高鐵血紅素流出,高鐵血紅素在 540 nm處有強(qiáng)吸收;加入受試物,在 540 nm處比色和測定MDA的含量,可以評價(jià)受試物的抗氧化能力。

由圖 4可知,WPHT在 10～600μg/mL范圍內(nèi),小鼠紅細(xì)胞溶血和 MDA的生成的抑制率與WPHT的濃度有明顯量效關(guān)系。隨著WPHT濃度的增加,紅細(xì)胞溶血和 MDA生成抑制率都增大。并且二者隨WPHT濃度的變化趨勢非常相似。說明沙棘茶水溶性多糖能抑制·OH引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化,從而保護(hù)膜系統(tǒng)的流動(dòng)性,維持正常的生理功能;使用Microcal Origin軟件對曲線進(jìn)行擬合,經(jīng)計(jì)算溶血抑制率和 MDA抑制率的 IC50分別為: 221μg/mL和 202μg/mL。二者的 IC50的值也非常接近,好于苦丁多糖和決明子多糖等[17,18]。

4 結(jié)論

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Study on the Antioxidation Activities ofWater Soluble Polysaccharides fromH ippophae Rham noidesTea

L I Fang-liang＊,Wang Rui,Zhang Hong-mei
Liao N ing Technical University,College of Science,Fuxin 123000,China

The antioxidant effects ofWater Soluble Polysaccharides extracted fromHippophae Rhamnoidestea(WPHT) were studied byin vitrofour different experiments:measuring reducing power,el iminating superoxide anion free radical experiment,el iminating hydroxyl free radical exper iment,inhibiting mice erythrocyte hemolysis and lipid peroxidation MDA induced by H2O2exper iment.The exper iment results were compared with Vc.The multiple antioxidant activity of WPHT was evidenced by significant reducingpower,superoxide anion free radical and hydroxyl free radical notable scavenging abilities and obvious inhibiting activity ofmice erythrocyte hemolysis and for mation ofMDA mediated by H2O2. The data obtained in thein vitromodels clearly established the antioxidant potency of theWPHT.

reducing power;Hippophae Rham noidesTea;polysaccharides;antioxidation;erythrocyte hemolysis

Q946.91;R285.5

A

1001-6880(2010)04-0671-04

2009-06-10 接受日期:2009-10-13

校優(yōu)秀青年科學(xué)研究基金(07-127)

＊通訊作者 Tel:0418-6696983 E-mail:lifangliang1974@126.com