高效液相色譜測(cè)定人血清格列吡嗪方法的研究

陸 英 江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院門診藥房（215300）

高效液相色譜測(cè)定人血清格列吡嗪方法的研究

陸 英 江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院門診藥房（215300）

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定人血清格列吡嗪藥物的濃度，具有靈敏度高，檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)。采用這種方法的精密度和回收率都能滿足測(cè)定人血清格列吡嗪濃度的要求。

高效液相色譜；人血清；格列吡嗪

格列吡嗪(GLi) 是第二代磺酰脲類口服降血糖藥，主要作用于胰島β細(xì)胞[1]，通過加強(qiáng)胰島素的作用，促進(jìn)內(nèi)源性胰島分泌對(duì)于非胰島素依賴型(Ⅱ型) 糖尿病的治療，是有效且安全的藥物[2]。為了研究格列吡嗪的生物利用度及其生物等效性，本研究采用高效液相色譜法(HPLC) 及DAD測(cè)定人血清中格列吡嗪的方法。

1 實(shí)驗(yàn)器材

1.1 儀器 HP1090M高效液相色譜儀，HP108309輸液系統(tǒng)，HP自動(dòng)進(jìn)樣器，HPDAD (二級(jí)管陣列檢測(cè)器)，HP9153A數(shù)據(jù)處理儀，HP Think Jet 打印機(jī)，HP 彩色作圖儀(以上均為美國(guó)惠普公司產(chǎn)品)，超級(jí)微量恒溫器HW—86(上海浦江分析儀器廠)。

1.2 色譜條件 色譜柱Lichrosorb Si60 5u 150mm× 4.6mm，流動(dòng)相甲醇:水= 50:50，流速1ml/min，DAD 檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm，測(cè)定靈敏度為0101AUFS，進(jìn)樣量為20μl。

1.3 藥品、試劑 格列吡嗪片，5mg/ 片，批號(hào)980706-1，山東省莒南制藥廠產(chǎn)品，美吡達(dá)(格列吡嗪片)，5mg/片，批號(hào)990821，海南金曉制藥有限公司產(chǎn)品。格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)9804005 含量98.5 %，上海市醫(yī)藥公司第十五制藥廠產(chǎn)品。甲醇，優(yōu)級(jí)純，北京化工廠產(chǎn)品，雙蒸水，本實(shí)驗(yàn)室自制。Wash 試劑，色譜純，美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 隨機(jī)選取某地區(qū)12名健康志愿者作為研究對(duì)象，男性，年齡（23.8±1.）歲（23.8±1.2）y，體重（67.5±5.32）kg，將12名研究對(duì)象隨機(jī)分成兩組，作如下實(shí)驗(yàn)安排：每組6個(gè)人，禁食12h后，對(duì)每個(gè)研究對(duì)象由肘靜脈采血4ml，放入肝素化試管中，第一組研究對(duì)象用溶有50g蔗糖100ml溫水送服10mg格列吡嗪片，第二組研究對(duì)象用溶有50g蔗糖100ml溫水送服10mg美吡達(dá)，兩組在服藥2h后統(tǒng)一進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐，并于服藥后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0h對(duì)每個(gè)研究對(duì)象由肘靜脈采血4ml，放入肝素化試管中，兩次采血的樣本均3 000r/min 離心15min，分別取各個(gè)樣本的血漿分裝入1.5ml的小離心管內(nèi)，-20℃的冰箱內(nèi)保存至測(cè)定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 ①格列吡嗪血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取16.24mg的格列吡嗪片，用流動(dòng)相將其溶解，并用容量瓶定容至20ml，配成濃度為8mg/ml，母液用流動(dòng)相稀釋成8μg/ml，之后用空白血漿依次稀釋，配制成濃度為800，400，200，100，50，25，12.5ng/ml的格列吡嗪血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液。②取上述血漿400μl加入100ml濃度為50mg/ml的尼索地平，之后再加入800μlWash試劑，混勻，并以3 000r/min 離心20min，之后吸取上清液800μl，并用超級(jí)微量恒溫器在37℃下蒸干，用100μl的流動(dòng)相溶解殘?jiān)筮M(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度/內(nèi)標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，建回歸方程，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。

2.3 血漿樣品處理 處理研究對(duì)象血漿樣品所采取的方法要求與處理標(biāo)準(zhǔn)血漿時(shí)的方法相同。

2.4 回收率 分別配制20，300，700ng/ml血漿格列吡嗪溶液，均按標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)樣5次，記錄實(shí)際測(cè)得的濃度結(jié)果，回收率=測(cè)得值/加入值。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別配制20，300，700mg/ml 格列吡嗪血漿溶液各10份，五份冷凍保存為作日間精密度做準(zhǔn)備，另外5份分別進(jìn)樣，同時(shí)記錄對(duì)應(yīng)的峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度，同樣的樣品連續(xù)進(jìn)樣5d，記錄相應(yīng)的峰面積，計(jì)算日間精密度[4]。

2.6 最低檢測(cè)濃度 按噪比3 :1 計(jì)算最低檢測(cè)濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的色譜條件，格列吡嗪與內(nèi)標(biāo)分離良好，保留時(shí)間分別為1.653，2.535min。血漿空白色譜圖和服用格列吡嗪后血漿色譜圖如圖1和圖2 所示。

圖1 格列吡嗪血清空白色譜圖

圖1 格列吡嗪血清樣品色譜圖※保留時(shí)間為1.636min的色譜峰為格列吡嗪

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 格列吡嗪回歸方程為：

Response Ration = 1.45(Amt Ratio)+10.7 r= 0.998

3.3 回收率試驗(yàn) 濃度為20，300，700ng/ml3種格列吡嗪血漿溶液的回收率為（93.2±10.2）%，（91.0±9.4）%和（94.8 ±5.7）%。

3.4 精密度試驗(yàn) 濃度為20，300，700ng/ml三種濃度格列吡嗪血漿溶液日內(nèi)精密度分別為5.88 %，4.85%，4.65%，日間精密度分別為12.14%，7.60%，5.22%。

按信噪比3:1計(jì)算格列吡嗪最低檢測(cè)濃度為15ng/ml[5]。

綜上所述，本文所用方法簡(jiǎn)便且快速準(zhǔn)確，可應(yīng)用于藥物的代謝動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究中。

[1] 張洪德,朱熊,周炳生,等.國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口格列吡嗪治療非胰島素依賴型糖尿病比較[J]. 新藥與臨床,1993 ,12(3):138.

[2] 葉發(fā)青,邢翔飛,肖若蕾,等.高效液相色譜法測(cè)定血漿中格列吡嗪的濃度 [J].醫(yī)學(xué)導(dǎo)報(bào),2002,21(7):440-441.

[3] 傅善基,劉向群,張健,等.人血清格列吡嗪高效液相色譜測(cè)定方法的研究[J].山東生物醫(yī)學(xué)工程,2002,21(3):31-3.

[4] 李瓊,李新中,徐平聲. HPLC 法測(cè)定血漿中格列吡嗪濃度[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2005,22(1):137-138.

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.23.164

1672-2779（2010）-23-0199-02

2010-09-25）