頸交感神經(jīng)干離斷對CCl4所致大鼠肝損傷肝功能的影響

曾 議,夏 鋒,田 峰,程 龍,王曙光

(第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院全軍肝膽外科研究所、西南肝膽外科醫(yī)院,重慶,400038)

當(dāng)前研究表明化學(xué)性去肝內(nèi)交感神經(jīng)可以減輕CCl4所致肝損害程度,有利于肝臟合成功能改善和膽紅素的代謝[1]。但對于交感神經(jīng)系統(tǒng)如何調(diào)控肝臟功能的途徑尚不明確。交感神經(jīng)系統(tǒng)由中樞和外周兩大部分組成,其中樞結(jié)構(gòu)包括初級中樞和高級植物性中樞,以及中樞間的聯(lián)系;外周結(jié)構(gòu)是由神經(jīng)節(jié)和聯(lián)合神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維組成,其分布、走形較為彌散,構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。肝臟交感神經(jīng)調(diào)控系統(tǒng)由腹腔神經(jīng)節(jié)、脊髓胸腰段、下丘腦交感中樞三個不同層次的中樞構(gòu)成[2]。本實驗應(yīng)用頸交感神經(jīng)離斷大鼠模型[3],探討在交感神經(jīng)調(diào)控系統(tǒng)高級中樞節(jié)段去交感神經(jīng)狀態(tài)下,對急性肝損傷時肝功能的影響,以了解肝臟的交感神經(jīng)調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

全自動生化分析儀、CCl4(重慶化學(xué)試劑公司),RM6280C多通道生理信號采集儀(成都儀器廠),CoulArray高效液像色譜-電化學(xué)檢測系統(tǒng)5600A CA-1001(USA),雙人雙目手術(shù)顯微鏡。

1.2 實驗動物與分組

健康雄性Wistar大鼠共30只,體質(zhì)量190～220 g,均由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分成3組,每組10只。

1.2.1 A組(正常對照組):大鼠經(jīng)0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,僅以腹腔注射相同劑量滅菌生理鹽水(0.2 mL/100 g):B假手術(shù)組(Sham組)大鼠以0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。麻醉成功后,脫毛劑脫去頸部切口毛發(fā),皮膚消毒取頸正中切口剪開皮膚、手術(shù)顯微鏡下分離氣管旁右側(cè),暴露右頸總動脈及神經(jīng)節(jié),于右側(cè)頸總動脈分叉處的背側(cè)面找到頸上神經(jīng)節(jié),距其下3 mm尋找右側(cè)頸交感神經(jīng)干?？梢娨恍毕蛲庀伦咝慰邕^頸總動脈前方的神經(jīng)纖維,以微量注射器針頭小心挑起、分離右頸交感神經(jīng)干,分離一段節(jié)后纖維,置于0.4 mm直徑鉑金絲正負(fù)電極上,懸空記錄神經(jīng)沖動發(fā)放電位,陰極電極夾于切緣皮膚。手術(shù)野滴注溫?zé)岬囊后w石蠟油以防神經(jīng)干燥,觀察神經(jīng)纖維放電的情況,如放電的幅度、波形等并打印記錄。待交感神經(jīng)放電趨于穩(wěn)定后,腹腔注射10%CCl4石蠟油液[4](0.2 mL/100 g,由CCl4原液和滅菌石蠟油按體積比1∶9配制而成);并持續(xù)記錄交感神經(jīng)干神經(jīng)沖動電位發(fā)放變化約10 min C頸交感干離斷組:大鼠在行前操作的基礎(chǔ)上,切斷右交感神經(jīng)干[5],腹腔注射10%CCl4溶液;手術(shù)完畢后縫合切口。手術(shù)組動物在麻醉清醒后,若出現(xiàn)同側(cè)眼裂變窄、瞳孔縮小等典型的霍納綜合征(Horner′s syndrome)則證明頸交感干離斷。

1.2.2 B、C組分別于實驗后第4、7、10天經(jīng)腹腔注射追加相同劑量10%CCl41次,A組注射相同劑量的生理鹽水,第10天注射完CCl4液24 h后。采取同一時段放血處死大鼠。處死前由下腔靜脈抽血,3 900 r/min離心10 min后取血清-20℃冰箱保存,檢測肝功能;處死后取同一部位肝組織,以冰生理鹽水沖洗干凈血跡后切取小塊肝組織,濾紙吸去多余水份,以CoulArray高效液像色譜-電化學(xué)法測定肝組織內(nèi)NE濃度;另取小塊肝組織,以 10%甲醛固定后行病理切片染色。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

全自動生化分析儀檢測各組肝功能各項指標(biāo),前白蛋白(PA):免疫比濁法;白蛋白(Alb):溴甲酚氯比色法;總膽紅素(TB)和直接膽紅素(BD):速率法。ALT、AST操作方法參見試劑盒說明書。

頸交感神經(jīng)神經(jīng)沖動發(fā)放的電生理記錄按參考文獻(xiàn)[6]方法加以改進(jìn)。

Coularray高效液相色譜-電化學(xué)法測定肝組織內(nèi)NE濃度。

肝組織石蠟切片HE染色按照石蠟切片HE染色常規(guī)造作進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 頸交感神經(jīng)干離斷狀態(tài)對肝臟功能各項指標(biāo)的影響

結(jié)果顯示:shame組和手術(shù)組相比較白蛋白和前白蛋白,結(jié)果有顯著差異(P<0.05);AST、ALT有顯著差異(P<0.05)。shame組與手術(shù)組總膽紅素比較具有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果表明,同shame組相比較,頸交感干離斷有利于CCl4所致肝損害后蛋白合成功能的改善、膽紅素的代謝和降低AST、ALT。

表1 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)( ±s)

表1 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)( ±s)

與假手術(shù)組比較,＊P<0.05

組別 正常對照組 假手術(shù)組 頸交感干離斷組ALT(IU/L)51±2 158±13 84±8＊AST(IU/L)47±4 225±5 144±16＊白蛋白(g/L)36.0±1.231.7±0.34 35.9±0.30＊前白蛋白(g/L)0.15±0.030.07±0.01 0.16±0.01＊總膽紅素(μ mol/L)0.7±0.13 2.1±0.18 1.3±0.3＊直接膽紅素(μ mol/L)0.5±0.12 1.8±0.2 1.0±0.2＊

2.2 頸交感神經(jīng)干經(jīng)腹腔注射CCl4前后電生理變化

采用RM6280C多通道生理信號采集儀記錄交感神經(jīng)電位發(fā)放。觀察神經(jīng)纖維放電的情況,如放電的幅度、波形等變異性較大。在手術(shù)顯微鏡下分離神經(jīng)纖維,直至放電較為單一為止,以使盡可能接近單纖維記錄:急性肝損傷造模前大鼠頸交感神經(jīng)干放電波幅較低、頻率均一、電壓趨于平穩(wěn),經(jīng)CCl4腹腔內(nèi)注射行肝損傷刺激以后,交感神經(jīng)干放電立刻增加、波伏增大,呈脈充式增強,持續(xù)記錄約5 min后,交感神經(jīng)電活動回復(fù)正常時波形。剪斷交感神經(jīng)干后,記錄波形立即消失,經(jīng)兩斷端均無法再次測出。

2.3 肝組織內(nèi)NE濃度

Coularray高效液相色譜-電化學(xué)法測定肝組織內(nèi)NE濃度,不同處理組色譜圖見圖1,各組肝組織內(nèi)去甲腎上腺素濃度實測值:正常對照組為(39.45±1.0)ng/mL,假手術(shù)組為(53.77±1.34)ng/mL,頸交感干離斷組為(45.98±0.76)ng/mL。頸交感干離斷組和正常組、shame組比較,差異非常顯著(P<0.01)。

結(jié)果說明:頸交感干離斷有效降低了肝組織內(nèi)NE濃度;假手術(shù)組和頸交感干離斷組經(jīng)CCl4行急性肝損傷造模處理后,肝組織內(nèi)NE濃度均較正常對照組升高。

圖1 不同處理組色譜圖

2.4 頸交感神經(jīng)干離斷對肝組織病理改變的影響

假手術(shù)組CCl4肝損傷后肝組織切片HE染色,肝組織充血明顯、匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤明顯,肝細(xì)胞混濁、腫脹、壞死。頸交感神經(jīng)干離斷后CCl4肝損傷后組織切片HE染色,肝組織充血、肝細(xì)胞混濁、腫脹較shame組明顯減輕,炎細(xì)胞浸潤較少。見圖2。

圖2 肝組織病理切片 HE 100倍

3 討 論

當(dāng)前研究表明,肝臟的交感神經(jīng)參與了肝臟的各種生理功能的調(diào)節(jié),如肝臟的血液循環(huán),糖代謝和酮體及膽汁的生成,尿素的排泌和氨的攝取等。肝臟交感神經(jīng)的節(jié)后纖維主要來源于腹腔神經(jīng)節(jié)和腸系膜神經(jīng)節(jié)。交感神經(jīng)調(diào)控系統(tǒng)由腹腔神經(jīng)節(jié)、脊髓胸腰段、下丘腦交感中樞三個不同層次的中樞構(gòu)成。Iwai M等的研究表明以刺激交感神經(jīng)興奮活化增強可以加重肝損傷[7],夏鋒等研究表明,肝內(nèi)去化學(xué)性交感神經(jīng)可以顯著減輕CCl4所致的肝損害[8],但中樞交感神經(jīng)系統(tǒng)對內(nèi)臟器官功能活動調(diào)節(jié)的神經(jīng)傳入和傳出通路一直沒有明確資料顯示,內(nèi)臟器官的神經(jīng)功能調(diào)控值得深入研究。

另有研究發(fā)現(xiàn),大鼠頸交感干離斷(TCST)TCST可以降低Willis環(huán)動脈血中NE的含量、增加頸動脈血流。切斷頸上神經(jīng)節(jié)前纖維而保存頸上神經(jīng)節(jié)可以保證節(jié)后纖維不變性。下丘腦-垂體-腎上腺軸及頸交感干-下頜下腺軸在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的相互作用中起重要作用。頸交感神經(jīng)干離斷后,減少了外周應(yīng)激刺激向中樞的傳入,進(jìn)而對交感-腎上腺系統(tǒng)的興奮具有抑制作用,可以減弱應(yīng)激性刺激產(chǎn)生的交感神經(jīng)中樞活化[9-10],同時可以干擾應(yīng)激產(chǎn)生的交感-腎上腺髓質(zhì)的反應(yīng),降低血漿兒茶酚胺水平,阻斷或改善隨后發(fā)生的一系列病理改變;四氯化碳在肝臟經(jīng)細(xì)胞色素P450激活為自由基CCl3,攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子,繼而與膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行共價結(jié)合,使蛋白質(zhì)代謝障礙,引起膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞。另外,CCl3可抑制細(xì)胞膜和微粒體膜上鈣泵的活性,使Ca2+內(nèi)流增加。此兩種途徑最終導(dǎo)致肝細(xì)胞漿中可溶性溶酶滲出入血,引起一系列生化指標(biāo)改變[11]。前白蛋白(PA)是一種半衰期較短而對肝細(xì)胞功能變化非常敏感的蛋白成分,能適時反應(yīng)肝細(xì)胞的蛋白合成功能。

本組實驗結(jié)果顯示:本實驗中頸感神經(jīng)傳入活動正常情況下趨于穩(wěn)定發(fā)放,放電電壓和波幅較弱。在腹腔注射CCl4后頸交感干的生物電放電活動立即增強,波伏和頻率明顯增加,幾乎沒有潛伏期;我們認(rèn)為可能系腹腔內(nèi)交感神經(jīng)末稍感覺纖維感受刺激后,神經(jīng)沖動沿內(nèi)臟大神經(jīng)向上經(jīng)交感神經(jīng)節(jié)傳遞。最終經(jīng)頸交感干的傳入刺激增多,致下丘腦交感中樞興奮增強,進(jìn)一步激活交感-腎上腺系統(tǒng),致血循環(huán)中兒茶酚胺增加。由此可能激活kupffer細(xì)胞活化,各種促炎因子表達(dá)上調(diào),最終促炎和抗炎因子平衡失調(diào),致組織細(xì)胞損害;反之離斷頸交感神經(jīng)干后,阻斷或減弱交感中樞激活的外周信息傳入,下丘腦-垂體-腎上腺軸激活減弱,阻斷或改善隨后發(fā)生的一系列病理改變。

本試驗結(jié)果表明頸交感神經(jīng)離斷在CCl4所致肝損傷有利于改善蛋白合成功能和膽紅素代謝,和降低血清AST、ALT。原因可能是在急性肝損傷的條件下,交感神經(jīng)處于高緊張性狀態(tài),從而起到高效的調(diào)控功能。一旦失去了這種調(diào)控作用則會產(chǎn)生功能失衡,引起代謝改變。而在基礎(chǔ)狀態(tài)下對代謝的調(diào)控功能則相對較低。另外,副交感神經(jīng)的調(diào)控與交感神經(jīng)存在著一種拮抗現(xiàn)象。它們共同對肝臟功能進(jìn)行控制。交感神經(jīng)中樞位于下丘腦的腹側(cè)正中,其生理功能偏向于異化代謝及分解作用。而副交感神經(jīng)中樞位于下丘腦外側(cè)部,其生理功能偏向于同化作用。當(dāng)交感神經(jīng)活化減弱以后抑了異化作用,而使同化作用的趨勢占優(yōu),所以可使蛋白的合成加強。肝組織內(nèi)去甲腎上腺素濃度在頸交感干離斷后較假手術(shù)組降低,結(jié)果說明頸交感干離斷有效降低了肝組織內(nèi)去甲腎上腺素濃度,交感神經(jīng)主要的神經(jīng)遞質(zhì)分泌受到了抑制。而肝組織內(nèi)去甲腎上腺素水平在頸交感干離斷后較正常對照組增高,說明神經(jīng)遞質(zhì)的釋放同時受到體液因素和神經(jīng)反饋調(diào)節(jié),另外可能還有其它機制參與。

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