順磁共振測定姜油樹脂的DPPH自由基清除率

葛慶豐，宋明軍，顧 林*

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

順磁共振測定姜油樹脂的DPPH自由基清除率

葛慶豐，宋明軍，顧 林*

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

應(yīng)用電子順磁共振(ESR)方法測定姜油樹脂對DPPH自由基的清除效果，結(jié)果表明：當(dāng)姜油樹脂中姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比達(dá)到2.0時，5min后就檢測不出DPPH自由基；姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為0.25時，可以清除50%的DPPH自由基。

電子順磁共振；姜油樹脂；DPPH自由基清除率

Abstract ：This study investigated the use of ESR for measuring the scavenging effect of gingerol oleoresin on DPPH free radicals.DPPH free radicals could not be detected after 5 min exposure to half molar amount of gingerol, an antioxidant component contained in gingerol oleoresin. The percentage of scavenged DPPH free radicals was 50% when the molar ratio of gingerol to DPPH free radicals was 1:4.

Key words：ESR；ginger oleoresin；scavenging rate of DPPH free radicals

自由基是一類具有高度活性，含有未配對電子的物質(zhì)[1]，能致細(xì)胞和細(xì)胞膜過氧化損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞膜功能喪失，是產(chǎn)生疾病的主要原因[2]。隨著自由基引起人們的關(guān)注，其天然提取抗氧化物質(zhì)清除自由基成為研究熱點(diǎn)。判定物質(zhì)清除自由基能力的常用方法有分光光度法、電子順磁共振波譜法等。

電子順磁共振(electron spin resonance，ESR)，此方法制樣簡單、檢測方便、快捷、靈敏度很高。DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，有個單電子，在515nm波長處有強(qiáng)吸收，其乙醇溶液呈深紫色，清除劑通過與單電子配對使其顏色逐漸消失。參照文獻(xiàn)[3-4]知，DPPH自由基法測定的機(jī)理一般認(rèn)為是DPPH自由基使待測的有機(jī)成分形成不穩(wěn)定的自由基中間體，進(jìn)而雙分子偶聯(lián)，形成穩(wěn)定的最終產(chǎn)物。

有害物質(zhì)進(jìn)一步對細(xì)胞造成傷害，從而導(dǎo)致疾病、癌癥、衰老。連鎖起始階段和連鎖成長階段會產(chǎn)生許多自由基，具有清除各種自由基能力的物質(zhì)稱為自由基清除型抗氧化劑。在生成的有害物質(zhì)對細(xì)胞造成傷害后起到修復(fù)再生作用的，被稱為該物質(zhì)具有修復(fù)再生機(jī)能，該作用主要通過對總抗氧化能力的測定來證明。

生姜中辣味成分具有很強(qiáng)的抗氧化活性[5-7]。姜辣素是生姜中重要的抗氧化成分，它具有顯著的抗氧化作用。生姜抗氧化劑具有良好的熱穩(wěn)定性，安全性強(qiáng)，有芳香味，可廣泛應(yīng)用于油脂、肉制品等食品中。因此，它是一種值得研究開發(fā)的天然抗氧化劑[8]。

本實(shí)驗(yàn)法對姜辣素進(jìn)行體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)。通過清除DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)來測定在自由基連鎖起始反應(yīng)階段是否具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

姜油樹脂 實(shí)驗(yàn)室自制[9]。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma公司；無水乙醇(AR) 上海振興化工一廠。

A300-10/12電子順磁共振波譜儀 德國Bruker公司.

1.2 方法

1.2.1 ESR操作參數(shù)的設(shè)置

使用A-300 EPR波譜儀，諧振腔為HSC(ER 4119)，頻率為X波段。掃場寬度100.000G，中心磁場3519.960G，微波頻率9.874GHz，測試溫度297K，調(diào)制頻率100.000kHz，調(diào)制幅度2.000G，微波功率20.104mW，時間常數(shù)327.680ms，掃場時間665.600s。

1.2.2 DPPH自由基的清除實(shí)驗(yàn)[10]

用無水乙醇先配1×103mol/L DPPH母液，于棕色瓶中避光低溫保存?zhèn)溆?，用時取DPPH母液稀釋為2×104mol/L。在50 μL毛細(xì)管中裝入DPPH溶液，放入諧振腔固定好，記錄EPR譜信號強(qiáng)度(I0)，并計算峰面積(S0)。然后，在毛細(xì)管中加入提取液，迅速混勻，放入諧振腔固定好，記錄EPR譜信號強(qiáng)度(Ix)，并計算峰面積(Sx)。按下式計算DPPH自由基的剩余率。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基的清除效果

姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為0.02時，測定姜辣素清除DPPH自由基的效果，獲得電子順磁共振波譜圖見圖1。

由圖1可知，隨著時間的延長，信號下降緩慢，5min后沒有較大的變化，說明姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為0.02時對DPPH自由基清除效果較差。

姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為0.2時，測定姜辣素清除DPPH自由基，獲得電子順磁共振波譜圖見圖2所示。

由圖2可知，5min后信號強(qiáng)度約減弱一半，隨后沒有變化，與圖1比較，姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為0.2時對DPPH自由基清除有明顯的效果。

姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為0.5時，測定姜辣素清除DPPH自由基，獲得電子順磁共振波譜圖見圖3所示。

由圖3可知，隨著時間的延長，信號強(qiáng)度逐漸減弱，與圖2比較，說明姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為0.5時對DPPH自由基清除效果較好。

圖1 姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為0.02時清除DPPH自由基電子順磁共振波譜Fig.1 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 0.02:1) for different periods of time

圖2 姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為0.2時清除DPPH自由基電子順磁共振波譜Fig.2 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 0.2:1) for different periods of time

圖3 姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為0.5時清除DPPH自由基電子順磁共振波譜Fig.3 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 0.5:1) for different periods of time

圖4 姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為0.8時清除DPPH自由基電子順磁共振波譜Fig.4 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 0.8:1) for different periods of time

圖5 姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為1.0時清除DPPH自由基電子順磁共振波譜Fig.5 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 1.0:1) for different periods of time

姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為0.8時，測定姜辣素清除DPPH自由基，獲得電子順磁共振波譜圖見圖4所示。

由圖4可知，隨著時間的延長，信號強(qiáng)度逐漸減弱，到25min后信號強(qiáng)度較弱，與圖3比較，說明姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為0.8時對DPPH自由基清除效果較好。

姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為1.0時，測定姜辣素清除DPPH自由基，獲得電子順磁共振波譜圖見圖5所示。

由圖5可知，隨著時間的延長，信號強(qiáng)度逐漸減弱，到25min后信號強(qiáng)度較弱，與圖4比較，說明姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為1.0時對DPPH自由基清除效果較好。

姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為1.2時，測定姜辣素清除DPPH自由基，獲得電子順磁共振波譜圖見圖6所示。

由圖6可知，5min時信號強(qiáng)度下降的很明顯，隨后信號強(qiáng)度逐漸減弱，到25min后信號強(qiáng)度較弱，與圖5比較，說明姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為1.2時對DPPH自由基清除效果較好。

姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為1.5時，測定姜辣素清除DPPH自由基，獲得電子順磁共振波譜圖見圖7所示。

由圖7可知，5min時信號強(qiáng)度下降的很明顯，隨后信號強(qiáng)度逐漸減弱，到25min后信號強(qiáng)度較弱，與圖6比較，說明姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為1.5時對DPPH自由基清除效果較好。

姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為2.0時，測定姜辣素清除DPPH自由基，獲得電子順磁共振波譜圖

圖6 姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為1.2時清除DPPH自由基電子順磁共振波譜Fig.6 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 1.2:1) for different periods of time

圖7 姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為1.5時清除DPPH自由基電子順磁共振波譜Fig.7 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 1.5:1) for different periods of time

圖8 姜辣素與DPPH自由基物質(zhì)的量比為2.0時清除DPPH自由基電子順磁共振波譜Fig.8 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 2.0:1) for different periods of time

由圖8可知，5min時已沒有信號，說明姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為2.0的條件下對DPPH自由基清除效果較好。

由以上實(shí)驗(yàn)可知，自由基的特征吸收磁場強(qiáng)度在3250～3450G之間，隨著時間的的延長，EPR譜信號強(qiáng)度降低，峰面積減小，反映了DPPH自由基的清除效果增強(qiáng)。隨著姜油樹脂中姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比的增加，其清除平衡的時間就越短，姜辣素清除自由基的效果更佳。當(dāng)姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比達(dá)到2.0時，5min后就檢測不出自由基。

2.2 姜辣素清除DPPH自由基動力學(xué)

根據(jù)系列圖1～8，可見DPPH自由基為五重峰，采用Origin7.0軟件計算峰面積，以峰面積大小來評價提取物清除DPPH自由基的能力。采用1.2.2節(jié)方法測定DPPH自由基剩余率。以時間為橫坐標(biāo)，DPPH自由基剩余率為縱坐標(biāo)，得到姜辣素清除DPPH自由基動力學(xué)曲線如圖9所示。

圖9 姜辣素與DPPH自由基不同物質(zhì)的量比時清除DPPH自由基動力學(xué)曲線Fig.9 Scavenging kinetics of DPPH free radicals by gingerol

EC50，定義為使起始DPPH自由基濃度降低50%所需提取物的量，其倒數(shù)(1/EC50)為抗自由基能力(ARP)。由定義可以看出，ARP越大，提取物越有效。

取姜辣素與自由基的物質(zhì)的物質(zhì)的量比為橫坐標(biāo)，自由基清除平衡時的DPPH自由基剩余率為縱坐標(biāo)作圖得圖10，計算EC50。

圖10 姜辣素清除DPPH自由基的EC50Fig.10 EC50of gingerol for scavenging DPPH free radicals

由圖10可見，姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比約為0.25時，對應(yīng)DPPH自由基的EC50，故其ARP為4。一些常見的抗氧化劑的ARP為：抗壞血酸3.7、BHA為4.17、BHT為4.2[11]。

3 討 論

采用順磁共振法測定姜油樹脂對DPPH自由基的清除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：姜油樹脂具有良好的抗DPPH自由基能力，姜油樹脂中姜辣素與DPPH自由基的物質(zhì)的量比為0.25時，可以清除50%的DPPH自由基。姜油樹脂能有效清除DPPH自由基，據(jù)參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]報道，姜油樹脂對羥基自由基、超氧自由基也有較好的清除效果。姜油樹脂含有的清除自由基的天然活性成分，可以進(jìn)一步研究開發(fā)高效、安全、穩(wěn)定的抗衰老食品的功效添加劑。

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Using ESR for Measuring DPPH Free Radical Scavenging Activity of Gingerol Oleoresin

GE Qing-feng，SONG Ming-jun，GU Lin*
(School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China )

TS201.2

A

1002-6630(2010)15-0121-05

2010-04-19

葛慶豐(1975—)，男，講師，碩士，主要從事食品科學(xué)研究。E-mail：qfge@yzu.edu.cn

*通信作者：顧林(1956—)，男，教授，本科，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及資源開發(fā)。E-mail：gulin@yzu.edu.cn