降鈣素受體在骨轉(zhuǎn)移瘤中的表達水平及意義

韓 楓

（河南省商丘市第一人民醫(yī)院骨科，河南商丘 476100）

骨轉(zhuǎn)移瘤已經(jīng)成為成年人中發(fā)病率最高的骨惡性腫瘤[1]，骨轉(zhuǎn)移瘤原發(fā)疾病多為乳腺癌、前列腺癌及肺癌等，隨病情進展常會引起病理性骨折、頑固性疼痛、高鈣血癥及神經(jīng)壓迫等并發(fā)癥，嚴重降低了患者的生活質(zhì)量。本文探討降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）在骨轉(zhuǎn)移瘤中的表達情況，并探討其相關(guān)性及表達意義，期望能為臨床應(yīng)用降鈣素（calcitonin，CT）治療骨轉(zhuǎn)移瘤提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月～2010年12月在我科確診后行手術(shù)切除的骨轉(zhuǎn)移瘤標本18例，同時搜集完整資料（包括患者的基本情況、實驗室檢查、影像學資料和病理診斷）。18例患者，其中，男性8例，女性10例；年齡35～73歲，平均57歲。腫瘤轉(zhuǎn)移部位，脊柱11例（頸椎1例，胸椎5例，腰椎4例，骶椎1例），骨盆4例，股骨近端2例，股骨遠端1例。根據(jù)X線表現(xiàn)將18例標本分為兩組：成骨表現(xiàn)組4例，溶骨表現(xiàn)組14例。所有患者術(shù)后經(jīng)病理確診均為骨轉(zhuǎn)移瘤，其中，12例發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶（肺癌4例，乳腺癌3例，腎癌2例，甲狀腺癌1例，前列腺癌1例，胃癌1例），6例經(jīng)全身檢查未發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶。同時選取我科在脊柱手術(shù)中切除的多余的正常棘突10例，設(shè)為對照組，其中，男性6例，女性4例；年齡35～65歲，平均50歲。取棘突部位：頸椎3例，胸椎3例，腰椎4例。

1.2 實驗儀器及試劑

電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療儀器廠），超低溫冰箱（青島海爾集團公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），GT16-3A離心機（北京時代北利離心機有限公司），切片機（德國Leitz公司），降鈣素受體鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，S-P免疫組化染色試劑盒（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司），PBS緩沖液，抗原修復液。

1.3 方法

1.3.1 取材包埋 切除的標本均置于10%福爾馬林溶液中固定15～20 h，然后放入5%硝酸銀溶液中脫鈣 48～72 h，此時用普通注射器針頭即可刺透骨質(zhì)，然后在自來水下連續(xù)沖洗72 h。梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，65℃浸蠟，制成蠟塊后放入-4℃冰箱中。

1.3.2 連續(xù)切片 切片機以4 μm厚度對蠟塊連續(xù)切片，貼于載玻片上，撈片后置60℃烤箱30～60 min，烤干備用。

1.3.3 HE染色 常規(guī)二甲苯脫蠟，酒精脫水，蘇木素染色，水洗，分化，反藍，伊紅染色，脫水，二甲苯透明后封片。

1.3.4 免疫組織化學操作 按免疫組織化學常規(guī)SP染色方法與免疫組織化學試劑盒說明操作。

1.3.5 對照組設(shè)定 PBS液代替一抗為陰性對照。以10例已知CTR陽性表達的正常骨組織作為陽性對照組。

1.3.6 結(jié)果判定標準及方法 所取標本免疫組織化學染色結(jié)果的判斷參照許良中等[2]提出的等級評分方法為標準，切片中細胞核和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，無棕黃色顆粒者為陰性。

1.3.7 統(tǒng)計學分析 采用陽性率作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，所得結(jié)果用χ2檢驗或精確概率法進行檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

免疫組織化學染色結(jié)果顯示CTR表達于正常骨組織和骨轉(zhuǎn)移瘤細胞漿中。CTR在正常骨組織中表達的陽性率為30.0%，在骨轉(zhuǎn)移瘤中表達的陽性率為83.0%，二者有顯著性差異（表1）。CTR在骨轉(zhuǎn)移瘤分組中的表達：溶骨組的陽性率為92.8%，成骨組的陽性率為50.0%，二者有顯著性差異（表2）。

表1 降鈣素受體在正常骨組織和骨轉(zhuǎn)移瘤中的表達（例）Tab.1 The expression of CTR in normal bone tissue and bone metastases(case)

表2 降鈣素受體在成骨組和溶骨組中的表達（例）Tab.2 The expression of CTR in osteogenic group and osteolytic group （case）

3 討論

CT是一種包含有32個氨基酸的多肽類激素，在體內(nèi)主要由甲狀腺C細胞合成、分泌，其在體內(nèi)存在于多種組織中。CT的生理作用廣泛，可以調(diào)控受精卵著床與胚胎發(fā)育，還可以促進腎臟對 Ca2+的排泄，抑制破骨細胞（osteoclast，OC）的溶骨作用，維持Ca2+的平衡。自1962年Copp等[3]首次報道CT后，人們發(fā)現(xiàn)到CT對骨吸收有明顯的抑制作用，并由此推測骨組織中可能存在CTR。1980年Warshasky等[4]利用電鏡放射自顯影的方法首次報道OC表面存在CTR。1986年Nicholson等[5]在體外培養(yǎng)OC時，采用放射配基結(jié)合分析證實了在OC及前體細胞上存在大量的CT特異性結(jié)合位點。1991年Lin等[6]首次成功克隆出豬的CTR cDNA，它翻譯的蛋白包括482個氨基酸，分子量為55 kD。人與豬CTR結(jié)構(gòu)相似，包含490個氨基酸，分子量8～9 kD，擁有7個跨膜結(jié)構(gòu)及連接跨膜結(jié)構(gòu)的4個胞外功能區(qū)（e1～4）和4個胞內(nèi)功能區(qū)（i1～4），目前已證明N-端的e2功能區(qū)是CT的結(jié)合位點。種種研究證實了OC和前體細胞表面存在大量的CTR，CT和CTR結(jié)合后，能抑制OC的骨吸收作用，促進成骨，增加骨量。CTR是包含490個氨基酸并擁有7個跨膜結(jié)構(gòu)G蛋白耦聯(lián)受體。

近年來隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)CTR在體內(nèi)多種組織中廣泛存在。1980年Martin等[7]在克隆的人乳腺癌細胞系（MCF-7）中發(fā)現(xiàn)CTR表達。1987年Silvestronil等[8]在人精原細胞上發(fā)現(xiàn)CTR表達。1997年Gellisple等[9]在原發(fā)性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)CTR表達，同時還發(fā)現(xiàn)這些表達CTR的癌組織表達骨橋蛋白。2005年張艷萍等免疫組化檢測不同發(fā)育階段小鼠胚胎和植入期子宮內(nèi)膜，發(fā)現(xiàn)CTR在小鼠胚胎和植入期子宮內(nèi)膜都有表達。2008年張豪偉等[10]發(fā)現(xiàn)骨巨細胞瘤和骨軟骨瘤中也有CTR表達。以上研究表明CTR可以在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤中表達，而在乳腺、前列腺、肺等正常組織中則無表達，說明CTR可能與CTR陽性的惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前已證明CTR在骨組織主要存在于OC膜上，CT和OC膜上的CTR結(jié)合后，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導機制，抑制OC的骨吸收作用。目前對于CT和CTR結(jié)合后在OC中的信號轉(zhuǎn)導機制已明確：一種信號轉(zhuǎn)導途徑以Ca2＋為第二信使，CT和CTR結(jié)合后激活Gp，Gp再激活磷脂酶C(PLC)，激活狀態(tài)的PLC將細胞膜中的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解為 IP3和二?；视停―G），IP3和胞膜內(nèi)的IP3受體結(jié)合，促進胞內(nèi)Ca2＋的釋放，提高胞內(nèi)Ca2＋水平，DG可以激活胞膜上的蛋白激酶C(PLC)，相關(guān)的蛋白發(fā)生磷酸化，增加Ca2＋的通透性，使胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學效應(yīng)；另一種是以cAMP為第二信使的信號轉(zhuǎn)導途徑，其轉(zhuǎn)導機制為：CT和CTR結(jié)合后激活霍亂敏感蛋白（Gs），進而激活腺苷酸環(huán)化酶，在Mg2＋存在的條件下催化ATP生成cAMP，以cAMP為第二信使激活蛋白激酶A，啟動級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生最終生物學效應(yīng)。CT和CTR結(jié)合后在腫瘤細胞中的轉(zhuǎn)導機制尚不清楚，需進一步研究。本研究通過對18例骨轉(zhuǎn)移瘤標本免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)：CTR陽性表達15例，CTR陰性表達3例，CTR陽性率為83.0%；而對照組10例正常骨組織中，CTR陽性表達3例，CTR陰性表達7例，CTR陽性率為30.0%，經(jīng)Fisher精確概率檢驗發(fā)現(xiàn)二者陽性率有顯著性差異。本研究中發(fā)現(xiàn)CTR在骨轉(zhuǎn)移瘤中高度表達，而在正常骨組織中低表達，說明骨轉(zhuǎn)移瘤的形成可能與其細胞表面的CTR有關(guān)，CTR在骨轉(zhuǎn)移瘤中高表達，可能是骨轉(zhuǎn)移瘤的一種新標志物。正常骨組織中CTR存在于OC上，骨轉(zhuǎn)移瘤中CTR可能存在于腫瘤細胞上，對骨轉(zhuǎn)移瘤中CTR進行檢測，將有助于骨轉(zhuǎn)移瘤的早期診斷和預后評估。骨轉(zhuǎn)移瘤的轉(zhuǎn)移途徑主要為血液循環(huán)途徑，少數(shù)經(jīng)淋巴循環(huán)系統(tǒng)，由于多數(shù)惡性腫瘤細胞表面表達CTR，為下一步應(yīng)用CT治療惡性腫瘤提供了可能，但是CT和腫瘤細胞表面CTR的結(jié)合機制以及結(jié)合后的生物學效應(yīng)尚不清楚。

骨腫瘤根據(jù)X線表現(xiàn)可以分為成骨型、溶骨型和混合型。骨轉(zhuǎn)移瘤在X線表現(xiàn)上成骨型和混合型少見，多為溶骨型表現(xiàn)。前列腺癌、肺癌、胃癌和近半數(shù)的乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移瘤X線表現(xiàn)為成骨型，而腎癌、甲狀腺癌、肺癌、結(jié)腸癌的X線表現(xiàn)多為溶骨性破壞。目前認為骨轉(zhuǎn)移瘤的溶骨作用與OC的骨吸收有關(guān)，OC的溶骨活性可被腫瘤細胞釋放的調(diào)節(jié)因子增強，從而加速骨的分解代謝，同時還可以抑制轉(zhuǎn)移灶的成骨作用，最終產(chǎn)生溶骨性病灶。其中較為重要的調(diào)節(jié)因子有甲狀腺素相關(guān)蛋白[11]與細胞核因子κB受體活化因子配基（RNAKL）。有文獻報道RNAKL在多種腫瘤細胞中大量表達，能導致OC活化和大量骨質(zhì)溶解破壞[12]。而某些骨轉(zhuǎn)移瘤表現(xiàn)為成骨性改變，這可能是由于轉(zhuǎn)移灶釋放的成骨因子促進成骨細胞的增殖和分化所致。研究發(fā)現(xiàn)由前列腺癌細胞產(chǎn)生的TGF-β是一種活性較強的成骨因子，能提高前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中成骨細胞的活性，因此前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中成骨型比較常見。同時前列腺癌細胞還能分泌成纖維細胞生長因子（FGF），它能刺激成骨細胞的增殖和成骨活性。CTR在溶骨型骨轉(zhuǎn)移瘤中高表達，CTR可能與上述細胞因子相互作用共同調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)移瘤的溶骨性或成骨性破壞有關(guān)。本研究18例患者，根據(jù)X線表現(xiàn)分為兩組：成骨表現(xiàn)組4例，CTR 陽性表達 2例（50.0%）；溶骨表現(xiàn)組 14例，CTR 陽性表達13例（92.8%），經(jīng)Fisher精確概率檢驗發(fā)現(xiàn)二者陽性率有顯著性差異。研究結(jié)果表明溶骨型骨轉(zhuǎn)移瘤中CTR表達水平高于成骨型，CTR的表達水平與轉(zhuǎn)移瘤的溶骨性破壞有關(guān)。CTR高表達的骨轉(zhuǎn)移瘤溶骨破壞比較明顯，而CTR低表達的骨轉(zhuǎn)移瘤成骨作用比較明顯。當然，在骨轉(zhuǎn)移瘤溶骨和成骨過程中還有其他細胞因子的參與，同時與原發(fā)腫瘤的性質(zhì)有關(guān)。因此，CTR并不是調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)移瘤溶骨的唯一因素，可能有其他因素相互作用共同調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)移瘤的溶骨作用。

本研究證實了CTR在骨轉(zhuǎn)移瘤中的表達水平高于正常骨組織，而且在溶骨型骨轉(zhuǎn)移瘤中的表達水平高于成骨型骨轉(zhuǎn)移瘤，為臨床進一步應(yīng)用CT診斷、治療骨轉(zhuǎn)移瘤溶骨性破壞提供了相關(guān)的理論基礎(chǔ)及思路。

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