王 慧，白 莉

（山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，山西太原 030001）

扁平苔蘚（lichen planus）是一種病因不明的慢性或亞急性炎癥性皮膚病，其組織學(xué)特征顯示為上皮基底細(xì)胞的液化變性、基底膜帶損傷。目前關(guān)于其基底膜帶損傷機(jī)制的研究甚少。本文旨在檢測扁平苔蘚中MIF、MMP-9的表達(dá)，進(jìn)一步探討兩者與扁平苔蘚基底膜帶損壞的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

病例組30例均系2008～2009年在我院皮膚科就診，經(jīng)臨床和病理確診的扁平苔蘚患者。其中，男17例，女13例；年齡20～64歲，平均41.9歲。所有患者在半年內(nèi)均未使用過激素和免疫抑制劑治療。于患者典型皮損處取材。對照組30例為同期在我院整形科、普外科所取的正常皮膚組織，其中，男20例，女10例；年齡 18～60歲，平均37.6歲。兩組患者年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。各標(biāo)本取材后分兩份，一份經(jīng)中性福爾馬林液固定，石蠟包埋后用于免疫組化染色；另一份予以液氮迅速冷凍后置于-80℃冰箱保存，用作RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑

兔抗人MIF多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，兔抗人MMP-9多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。二步法PV-6000免疫組織化學(xué)檢測試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。MIF、MMP-9引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法 采用PV-6000二步法：備用標(biāo)本進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片后脫蠟，3%H2O2去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶； 滴加一抗 （MIF濃縮液1∶150稀釋，MMP-9濃縮液1∶100稀釋），37℃孵育 1 h； 滴加二抗 PV-6000，37℃孵育 20 min；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、封片。

1.3.2 RT-PCR法 采用Trizol一步法提取各標(biāo)本總RNA，并用分光光度法檢測其濃度及純度。加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，將其置于PCR反應(yīng)體系，按RT-PCR試劑盒說明擴(kuò)增GAPDH （作為內(nèi)參照）、MIF、MMP-9。各基因引物如下，GAPDH 上游引物：5′-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3′，下游引物∶5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG GA-3′，擴(kuò)增片段 307 bp。MIF 上游引物：5′-AGA ACC GCT CCT ACA GCA AG-3′， 下游引物：5′-ATT TCT CCC CAC CAG AAG GT-3′，擴(kuò)增片段234 bp。MMP-9上游引物：5′-TTG ACA GCG ACA AGA AGT GG-3′，下游引物：5′-GCC ATT CAC GTC GTC CTTAT-3′，擴(kuò)增片段179bp。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2min，94℃變性 30 s， 58℃（GAPDH）、52℃（MIF）、56℃（MMP-9）退火 20 s，72℃延伸30 s，共32次循環(huán)。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂凝膠電泳后，用圖像分析儀掃描分析。

1.4 結(jié)果判定

免疫組化結(jié)果以細(xì)胞核或細(xì)胞漿著黃色或棕黃色為陽性，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)分析陽性區(qū)域積分光密度（IOD）值，以IOD值大小代表陽性產(chǎn)物的多少；RT-PCR檢測結(jié)果以出現(xiàn)擴(kuò)增條帶為陽性，PCR產(chǎn)物的含量以累積光密度（OD）表示。以同一標(biāo)本MIF、MMP-9與內(nèi)參照GAPDH的OD值來判定兩種組織中MIF、MMP-9的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 扁平苔蘚組織與正常皮膚組織中MIF、MMP-9的表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示，扁平苔蘚中MIF、MMP-9的陽性表達(dá)主要分布在表皮全層角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮淺層浸潤的淋巴細(xì)胞的胞漿中；而在正常皮膚組織中均呈陰性或弱陽性表達(dá)。兩者在扁平苔蘚皮損區(qū)的表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。扁平苔蘚皮損中 MIF、MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.636， P＜0.01）。扁平苔蘚組與正常皮膚組之間MIF、MMP-9的IOD值比較見表1。

表1 扁平苔蘚與正常皮膚組織中MIF、MMP-9表達(dá)水平的比較（±s）Tab.1 The expression of MIF and MMP-9 in lichen planus and normal skin(±s)

表1 扁平苔蘚與正常皮膚組織中MIF、MMP-9表達(dá)水平的比較（±s）Tab.1 The expression of MIF and MMP-9 in lichen planus and normal skin(±s)

組別 例數(shù) MIF 30 30扁平苔蘚組正常皮膚組t值 P值--12.374±1.365 6.373±1.693 15.111 0.000 MMP-9 14.189±1.538 7.094±2.038 15.221 0.000

2.2 扁平苔蘚與正常皮膚組織中MIF、MMP-9 mRNA的表達(dá)水平

RT-PCR結(jié)果顯示，各組織均穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)參照基因GAPDH。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析扁平苔蘚皮損中MIF的mRNA、MMP-9的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常皮膚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 扁平苔蘚與正常皮膚組織中MIF、MMP-9 mRNA表達(dá)水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of the expression of MIF and MMP-9 mRNA in lichen planus and normal skin(±s)

表2 扁平苔蘚與正常皮膚組織中MIF、MMP-9 mRNA表達(dá)水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of the expression of MIF and MMP-9 mRNA in lichen planus and normal skin(±s)

扁平苔蘚組正常皮膚組t值P值組別 例數(shù) MIF/GAPDH 30 30--0.907±0.091 0.553±0.075 16.454 0.000 MMP-9/GAPDH 0.959±0.059 0.635±0.081 17.759 0.000

3 討論

目前廣泛認(rèn)為扁平苔蘚是一種細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。研究證明，CD8＋T細(xì)胞與LP皮損的基底細(xì)胞損傷以及皮損的持續(xù)存在有關(guān)[1]。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）是由活化的T淋巴細(xì)胞分泌的一種淋巴細(xì)胞因子。它通過抑制巨噬細(xì)胞遷移，使巨噬細(xì)胞在炎癥局部激活、黏附、浸潤并分泌一些細(xì)胞因子，這些因子又可促進(jìn)MIF的分泌，從而造成一個(gè)慢性反復(fù)的炎癥過程。MIF可作為免疫調(diào)節(jié)劑參與機(jī)體各種病理生理過程，在自身免疫疾病以及抗原遞呈過程中起重要作用[2]。最近的研究也發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞內(nèi)MIF的水平為B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的2倍[3]。本研究顯示，MIF在扁平苔蘚中的表達(dá)明顯高于正常皮膚，因此推測MIF的過度表達(dá)可能在扁平苔蘚的發(fā)病中起重要作用。

MMP-9屬于MMPs中的明膠酶，多來源于T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，主要降解基底膜帶中的重要成分Ⅳ型膠原和層黏連蛋白，從而造成基底膜帶的損壞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示扁平苔蘚中MMP-9表達(dá)增高，表明MMP-9可能與扁平苔蘚基底膜帶破壞有關(guān)，這與丁政云等[4]的研究結(jié)果一致。

有研究證明MIF能誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)上調(diào)[5-6]，且研究認(rèn)為MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)有幾個(gè)可以與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的位點(diǎn)，包括NF-κB和活化蛋白-1（AP-1）等元件的結(jié)合位點(diǎn)，這些活化因子的結(jié)合是MMP-9表達(dá)所必需的[7]。MMP-9的轉(zhuǎn)錄有賴于一些細(xì)胞因子、生長因子等與這些元件的相互作用。本研究表明，扁平苔蘚中MIF、MMP-9的蛋白及mRNA均升高，且二者表達(dá)呈正相關(guān)，提示MIF可能通過一系列途徑上調(diào)MMP-9的轉(zhuǎn)錄活性而最終調(diào)節(jié)MMP-9蛋白水平的增高。激活的MMP-9使基底膜帶遭到破壞，除可使OLP表皮細(xì)胞失去生存信號(hào)而凋亡外，還使更多的淋巴細(xì)胞進(jìn)入上皮加劇其損傷[8]。凋亡的表皮細(xì)胞又無法合成基底膜帶的主要成分Ⅳ型膠原和層黏連蛋白，加重了基底膜帶的損傷。這一連鎖反應(yīng)最終可致基底細(xì)胞液化變性，產(chǎn)生扁平苔蘚的臨床和病理變化。

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