復(fù)元膠囊對大鼠實驗性骨關(guān)節(jié)炎軟骨IL-6、bFGF的干預(yù)研究

梁曉芳，李榮亨，唐 靜（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶市 400016）

復(fù)元膠囊對大鼠實驗性骨關(guān)節(jié)炎軟骨IL-6、bFGF的干預(yù)研究

梁曉芳＊，李榮亨#，唐 靜（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶市 400016）

目的：研究復(fù)元膠囊對大鼠實驗性骨關(guān)節(jié)炎（OA）軟骨白細(xì)胞介素-6（IL-6）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表達(dá)的影響。方法：Hulth法復(fù)制大鼠OA模型，隨機(jī)分為對照、模型、四環(huán)素和復(fù)元膠囊高、中、低劑量組。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)10周。10周后取軟骨標(biāo)本，行大體觀察、Mankin’s評分及免疫組化測定軟骨中IL-6、bFGF的表達(dá)水平，并將IL-6、bFGF的表達(dá)水平與Mankin’s評分指數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果：復(fù)元膠囊各組關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評分、IL-6表達(dá)水平均低于模型組（P＜0.01或P＜0.05），bFGF表達(dá)水平均高于模型組（P＜0.01）；復(fù)元膠囊各劑量組Mankin’s評分差異具有顯著性（P＜0.05），IL-6表達(dá)水平與關(guān)節(jié)病理改變的Mankin’s評分指數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.01），bFGF表達(dá)水平與關(guān)節(jié)病理改變的Mankin’s評分無明顯相關(guān)。結(jié)論：復(fù)元膠囊能下調(diào)大鼠OA軟骨IL-6的表達(dá)，上調(diào)bFGF的表達(dá)，其作用呈劑量依賴性。高劑量復(fù)元膠囊抗大鼠OA作用與四環(huán)素相當(dāng)。

骨關(guān)節(jié)炎；復(fù)元膠囊；白細(xì)胞介素-6；堿性成纖維細(xì)胞生長因子

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是中老年人最常見的關(guān)節(jié)疾病。OA的產(chǎn)生，是一系列生物化學(xué)及生物力學(xué)因素共同作用的結(jié)果，最終導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的降解。軟骨基質(zhì)降解和修復(fù)失衡的始發(fā)路徑由細(xì)胞因子及化學(xué)增活素介導(dǎo)。在體及體外實驗研究均表明，阻斷這些細(xì)胞因子及化學(xué)增活素可消除其效應(yīng)。在OA患者軟骨組織及關(guān)節(jié)滑液中，白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量明顯升高，并呈隨病情加劇而升高的趨勢[1]。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）是目前已知最強(qiáng)的促細(xì)胞生長因子，可刺激成軟骨細(xì)胞增殖和分化，并具有反分化作用，能抑制軟骨鈣化。研究表明，bFGF參與膠原及軟骨細(xì)胞的再生[2]，在OA的軟骨及基質(zhì)修復(fù)中發(fā)揮重要作用。本文主要研究復(fù)元膠囊（Fyc）對大鼠實驗性O(shè)A軟骨IL-6、bFGF的影響，探討其抗OA的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

HWS-40B型恒溫水浴箱（江蘇太倉實驗設(shè)備廠）；MDF 328型低溫冰箱（日本三洋公司）；BX-50型生物顯微鏡（日本Olympus公司）；HPS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

Fyc（重慶希爾安藥業(yè)公司，批號：20090203，規(guī)格：每粒0.41 g）；四環(huán)素（太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司，批號：20090412，規(guī)格：每片250 mg）；大鼠IL-6及bFGF免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；青霉素（華北制藥股份有限公司，批號：D0809103）。

1.3 動物

SD清潔級大鼠60只，♂，體質(zhì)量（300±10）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXY（渝）20020003）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制及分組、給藥

隨機(jī)選10只SD大鼠為對照組，行皮膚切開后縫合；剩余50只以Hulth法[3]復(fù)制模型。術(shù)后予iv青霉素8×104IU·kg-1，每天1次，連續(xù)7 d。術(shù)后1周將模型大鼠隨機(jī)分為模型、四環(huán)素（50 mg·kg-1）和Fyc高、中、低劑量（2 229.9、743.3、371.65 mg·kg-1）組，ig 給藥，每天1次，且每天驅(qū)趕大鼠跑步30 min，連續(xù)10周。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 大體觀察關(guān)節(jié)軟骨 軟骨標(biāo)本按以下原則評分：關(guān)節(jié)面光整，色澤正常（0分）；關(guān)節(jié)面粗糙，有裂隙，色澤灰暗（1分）；關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損達(dá)軟骨表中層（2分）；關(guān)節(jié)面潰瘍形成，軟骨缺損達(dá)軟骨深層（3分）；軟骨剝脫，軟骨下骨暴露（4分）。

2.2.2 光鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨 取股骨內(nèi)髁及脛骨平臺軟骨標(biāo)本，4%多聚甲醛固定，10%EDTA脫鈣2周，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，依據(jù)Mankin’s標(biāo)準(zhǔn)評分。

2.2.3 免疫組化檢測IL-6、bFGF蛋白表達(dá) IL-6、bFGF表達(dá)按免疫組化試劑盒說明書操作。圖像分析：每個標(biāo)本取4張切片，每張切片隨機(jī)取5個視野，用北航醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)測定陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大體觀察結(jié)果

對照組軟骨面光滑，呈淡藍(lán)色。模型及各用藥組軟骨面粗燥，呈淡黃色毛刺狀，以模型組最突出，關(guān)節(jié)腔積液，滑膜顯著增生，軟骨面可見裂紋、糜爛及潰瘍形成，部分潰瘍深達(dá)軟骨下骨。Fyc各劑量組及四環(huán)素組損傷較模型組輕。各組關(guān)節(jié)軟骨大體評分結(jié)果見表1。

3.2 光鏡觀察結(jié)果及Mankin’s評分

對照組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，潮線完整。模型組軟骨染色不均，裂隙多，部分深達(dá)鈣化帶，細(xì)胞數(shù)目減少，排列紊亂，見多重潮線。四環(huán)素及Fyc各劑量組Mankin’s評分較模型組低。Mankin’s評分結(jié)果見表1。

表1 各組關(guān)節(jié)軟骨大體及Mankin’s評分（±s）Tab 1 Macroscopic grading score and Mankin’s score in each grou（p±s）

表1 各組關(guān)節(jié)軟骨大體及Mankin’s評分（±s）Tab 1 Macroscopic grading score and Mankin’s score in each grou（p±s）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

Mankin’s評分0.2±0.421 8.4±0.966＊4.2±0.918##3.4±0.966##5.9±0.994#7.4±1.173#n組別對照組模型組四環(huán)素組Fyc高劑量組Fyc中劑量組Fyc低劑量組10 10 10 10 10 10大體評分0 3.4±0.699＊1.9±0.567##1.7±0.674##2.6±0.699#2.9±0.737

3.3 軟骨組織中IL-6和bFGF的表達(dá)

3.3.1 IL-6的表達(dá) 模型組全層軟骨中IL-6表達(dá)較對照組顯著升高（P＜0.01），各用藥組IL-6表達(dá)顯著低于模型組（P＜0.01）；Fyc高劑量組與四環(huán)素組IL-6表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）。各組關(guān)節(jié)軟骨IL-6表達(dá)水平比較見表2。

3.3.2 bFGF的表達(dá) 對照組軟骨bFGF均勻分布，模型組軟骨bFGF表達(dá)較對照組高（P＜0.01），各給藥組bFGF表達(dá)顯著高于模型組（P＜0.01）；Fyc高劑量組bFGF表達(dá)高于四環(huán)素組（P＜0.05）。各組關(guān)節(jié)軟骨bFGF表達(dá)水平比較見表2。

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨IL-6、bFGF表達(dá)水平比較（±s）Tab 2 Expression of IL-6 and bFGF in each group（±s）

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨IL-6、bFGF表達(dá)水平比較（±s）Tab 2 Expression of IL-6 and bFGF in each group（±s）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

n組別對照組模型組四環(huán)素組Fyc高劑量組Fyc中劑量組Fyc低劑量組10 10 10 10 10 10 IL-6表達(dá)0.193±0.015 0.336±0.028＊0.250±0.016#0.259±0.014#0.288±0.024#0.299±0.015#bFGF表達(dá)0.558±0.018 0.595±0.024＊0.685±0.027#0.738±0.022#0.679±0.024#0.632±0.019#

3.3.3 Pearson相關(guān)分析 （1）IL-6與Mankin’s評分：兩者相關(guān)系數(shù)r＝0.963 8，P＜0.01，呈顯著正相關(guān)；（2）bFGF 與Mankin’s評分：兩者相關(guān)系數(shù)r＝0.154，P＞0.05，無顯著相關(guān)。IL-6、bFGF表達(dá)率與Mankin's評分的相關(guān)性見圖1。

4 討論

OA屬于中醫(yī)“痹證”、“骨痹”范疇，其病因病機(jī)概括起來，一為因虛致病：肝腎精虛，無以主骨養(yǎng)筋，筋骨失養(yǎng)，風(fēng)寒濕邪入侵而為痹；二為因病致虛：跌仆閃挫，筋骨勞損，致氣虛血瘀，久則肝腎虧損，氣血不調(diào)，脈絡(luò)失和而為痹。本病為本虛標(biāo)實之證，F(xiàn)yc配伍淫羊霍、鹿角膠、黃芪、川芎、丹參、三七粉等中藥，以補(bǔ)腎益氣、活血化瘀為法，標(biāo)本兼治，為臨床治療OA的有效復(fù)方。前期研究表明，F(xiàn)yc可減輕軟骨病變，對軟骨退變有防治作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，OA是多因素共同作用下，軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨下骨三者間分解和合成代謝失衡的結(jié)果。關(guān)節(jié)軟骨退化及破壞是OA的主要病理特征。許多細(xì)胞因子及蛋白酶參與了關(guān)節(jié)軟骨降解的發(fā)生發(fā)展。IL-6是一種多效細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)，IL-6誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的降解，在骨重建過程中調(diào)控骨吸收及生成之間的平衡、誘導(dǎo)MMP-13表達(dá)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)中二型膠原的降解[3]。在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中IL-6表達(dá)顯著增加；對體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞，IL-6可抑制bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞集落形成，抑制軟骨基質(zhì)蛋白多糖的合成，并顯著增強(qiáng)IL-1β誘導(dǎo)的蛋白多糖降解[4]，提示IL-6是一個軟骨細(xì)胞增生及關(guān)節(jié)軟骨代謝的負(fù)向調(diào)節(jié)劑。

此外，OA同軟骨細(xì)胞凋亡與增殖失衡關(guān)系密切。大量研究表明，OA患者有典型的軟骨細(xì)胞凋亡，凋亡數(shù)量與OA分級顯著相關(guān)[5]。bFGF對軟骨細(xì)胞既是絲裂原又是形態(tài)發(fā)生因子，對培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖及基質(zhì)代謝有促進(jìn)作用，隨培養(yǎng)基中bFGF的濃度增加，體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞DNA含量明顯增加。當(dāng)軟骨細(xì)胞生長、分裂活躍時，只有存在bFGF，才能維持軟骨細(xì)胞的表現(xiàn)型。bFGF甚至可將已成熟或轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞的細(xì)胞反分化為軟骨細(xì)胞[6]。研究表明，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞bFGF-mRNA在兔實驗性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨原位表達(dá)，上調(diào)bFGF-mRNA表達(dá)，可減輕軟骨病變[7]。提示bFGF與OA關(guān)系密切。

近年研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類抗生素可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶、抑制一氧化氮生成，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，并可作用于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，其對OA軟骨的多途徑保護(hù)作用已得到證實[8]。本研究采取四環(huán)素作為陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6表達(dá)與軟骨病變相平行，呈顯著正相關(guān)，F(xiàn)yc及四環(huán)素治療可降低IL-6表達(dá)、減輕軟骨病變，提示IL-6可作為OA監(jiān)測病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)及治療的作用靶點(diǎn)。Fyc高、中、低劑量組之間，軟骨病變的Mankin’s評分差異具有顯著性（P＜0.05），隨Fyc劑量增加，大鼠OA病變減輕，提示其抗OA作用呈劑量依賴性。Fyc高劑量組bFGF表達(dá)顯著高于四環(huán)素組（P＜0.05），而二者軟骨病變、IL-6表達(dá)無顯著差異，F(xiàn)yc高劑量組關(guān)節(jié)軟骨局部更高的bFGF水平未產(chǎn)生更強(qiáng)的促細(xì)胞增生及基質(zhì)修復(fù)效果，可能提示bFGF對軟骨細(xì)胞的效應(yīng)受多種因素影響，在OA治療中，單純增加病變關(guān)節(jié)局部bFGF水平所獲得的益處有一定的限度，不能有力阻止疾病進(jìn)展。骨關(guān)節(jié)炎為損傷-修復(fù)性疾病，軟骨基質(zhì)受損丟失、軟骨細(xì)胞凋亡及病理性過度修復(fù)增生同時存在，治療中應(yīng)兩個方面同時兼顧。

綜上所述，IL-6及bFGF與OA密切相關(guān)，可作為治療的作用靶點(diǎn)。Fyc及四環(huán)素通過降低病變局部IL-6表達(dá)，上調(diào)bFGF表達(dá)而減輕OA軟骨基質(zhì)降解，促進(jìn)損傷修復(fù)，可能是其治療OA的重要機(jī)制之一。Fyc抗OA作用呈劑量依賴性，其作為一個療效肯定、無明顯不良反應(yīng)的抗OA藥物，值得進(jìn)一步臨床研究。

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Effects of Fuyuan Capsule on the Expression of Interleukin-6 and Basic Fibroblast Growth Factor in Rats with Experimental Osteoarthritis

LIANG Xiao-fang，LI Rong-heng，TANG Jing（Dept.of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To observe the effects of Fuyuan capsule on the expression of interleukin-6（IL-6）and basic fibroblast growth factor（bFGF）in rats with experimental osteoarthritis（OA）.METHODS：OA models were induced by Hulth technique.Model rats were randomly divided into six groups：control group，model group，tetracycline group，F(xiàn)uyuan capsule high-dose，medium-dose and low-dose groups.Those groups were given relevant drug via i.g.gtt once a day for 10 weeks.Articular cartilages were obtained ten weeks later.Histomorphology of cartilage were evaluated according to macroscopic grading score and Mankin’s score was conducted.Expression of IL-6 and bFGF in articular cartilage were detected by immunochistochemistry technology.Pearson correlation analysis was carried out to determine Mankin’s index and the expression of IL-6 and bFGF in articular cartilage.RESULTS：Mankin’s score and the expression of IL-6 in Fuyuan capsule groups were lower than in model group（P＜0.01 orP＜0.05）；the expression level of bFGF in Fuyuan capsule groups were higher than in model group（P＜0.01）；there was significant difference in Mankin’s score among Fuyuan capsule groups（P＜0.05）.Pearson correlation analysis showed that the expression of IL-6 in the articular cartilage was positively correlated with the pathological change of joint（P＜0.01）.There was no significant correlation between the expression of bFGF in the articular cartilage and Mankin’s score.CONCLUSION：Fuyuan capsule can down-regulate the expression of IL-6 and up-regulate the expression of bFGF in dose-dependent manner.The treatment effect of high-dose Fuyuan capsule is identical to tetracycline in the treatment of OA.

Osteoarthritis；Fuyuan capsule；Interleukin-6；Basic fibroblast growth factor

R255.82；R97

A

1001-0408（2010）35-3287-03

2010-05-21

2010-06-08）