岡田酸致培養(yǎng)皮層神經(jīng)元毒性作用的研究

趙晉楓,王 丹,李靈敏,劉乃紅,張 策

阿爾茲海默病(Alzheimer's disease,AD)即老年性癡呆是以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能喪失為臨床特征的大腦退行性疾病[1],神經(jīng)細(xì)胞外以β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積為核心形成老年斑(senile plaques,SP),神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)以異常過度磷酸化的tau蛋白為核心形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangle,NFTs),tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白主要存在于軸突內(nèi),它的主要功能是促進(jìn)微管的形成和保持微管的穩(wěn)定性[2]。研究表明,tau蛋白磷酸化程度是體內(nèi)多種蛋白激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶的去磷酸化兩種作用平衡的結(jié)果,其中,PP2A是腦內(nèi)調(diào)節(jié)tau蛋白去磷酸化主要的磷酸酶。岡田酸(okadaic acid,OA)是一種海洋生物提取物,對蛋白磷酸酶2A(PP2A)有特異性抑制作用[3],研究證實,OA能特異性降低PP2A活性引起神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白tau異常過度磷酸化[4,5],繼而引起神經(jīng)元毒性。

1 材料與方法

1.1 皮層神經(jīng)元的培養(yǎng) 選用新生3 d以內(nèi)的Wister大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)動物管理中心提供),乙醚麻醉后,常規(guī)消毒,打開顱骨,取出兩側(cè)大腦半球,置于D-Hank's液中。剝除腦膜,分離出大腦皮層組織。將皮層組織銳性切割成1 mm3大小,轉(zhuǎn)移至離心管,加入0.125%的胰酶,小心吹打后靜置2 min,吸出并收集上清液,用D-Hank's液重懸沉淀的組織,再次吹打,直至均形成單細(xì)胞懸液。1 000 r/min離心5 min,棄上清液。加入全培液,吹打均勻。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板上(M TT測定是細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板上),置 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁3 d后,依據(jù)細(xì)胞生長情況,按每毫升培養(yǎng)液加入6 μ L10 μ mol/L的阿糖胞苷作用 24 h～48 h,以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長,使神經(jīng)元得以純化。根據(jù)細(xì)胞生長速度和培養(yǎng)液的pH變化,2 d～3 d半量換液。

1.2 實驗分組 將Wister大鼠隨機(jī)分為正常組、5 nmol/L OA組、10 nmol/L OA組、20 nmol/L OA組與皮層神經(jīng)元共培養(yǎng)。

1.3 乳酸脫氫酶(LDH)的測定 加入OA24 h后,收集培養(yǎng)上清液,用PBS洗兩遍,每瓶加入0.1 mol/L PBS-0.05 mmol/L EDTA(pH8.0)3 mL,再加入 150μ L 1%Triton-X100,用長吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞溶解,收集細(xì)胞懸液。參照試劑盒說明書測定培養(yǎng)液LDH的活性。

1.4 四唑鹽(MTT)法測定細(xì)胞存活率 取96孔板培養(yǎng)的10 d左右的細(xì)胞,吸棄各孔原培養(yǎng)液,加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基100 μ L,再加入 5 mg/mL M TT 工作液 20 μ L,混 勻,37℃孵育4 h。吸棄各孔培養(yǎng)液,每孔加入100μ L DM SO,振蕩10 min,使其充分溶解,在酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔A值。以正常組A值均數(shù)為100%,計算細(xì)胞存活率(%)=各孔A值/正常值A(chǔ)值均數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 原代細(xì)胞呈貼壁生長,接種1 d后,細(xì)胞完全貼壁,形成橢圓形的芽孢狀,周圍有明顯的光暈,細(xì)胞折光性好,活性強(qiáng)。3 d后加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長,并觀察細(xì)胞的增殖情況,得到純化的神經(jīng)元。培養(yǎng)至10 d左右細(xì)胞狀況良好,胞體呈梭形或錐形,胞漿透明,折光性強(qiáng),有明顯的立體感,突起發(fā)育好,相互交織成網(wǎng)狀?？梢杂脕磉M(jìn)行以下試驗。

2.2 LDH檢測(見表1) 加入OA后,隨著濃度的增加,LDH也顯著增加,且呈現(xiàn)劑量依賴性,5 nmol/L OA組與正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。顯微鏡觀察顯示,加入20 nmol/L OA后大部分神經(jīng)元的胞體折光性下降,突起回縮明顯,甚至斷裂溶解成碎片,而5 nmol/L的OA與正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 不同濃度OA對LDH的影響(±s) U/mg?prot

表1 不同濃度OA對LDH的影響(±s) U/mg?prot

組別 n LDH正常組 5 115.874±6.641 5 nmol/L OA組 5 121.434±8.259 10 nmol/L OA組 5 157.754±9.0101)20 nmol/L OA組 5 183.714±6.0651)與正常組比較,1)P＜0.05

2.3 M TT檢測(見表2) 正常組細(xì)胞存活率為100%,加入OA后,細(xì)胞活力顯著降低,5 nmol/L OA組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,10 nmol/L OA組、20 nmol/L OA組的OA引起細(xì)胞活力逐漸下降(P＜0.05),表現(xiàn)為M TT水平降低。

表2 不同濃度OA對MT T的影響(±s)

表2 不同濃度OA對MT T的影響(±s)

組別 n OD值 存活率(%)正常組 5 0.513±0.047 100.00±0.00 5 nmol/L OA 組 5 0.472±0.045 92.01±8.77 10 nmol/L OA 組 5 0.373±0.035 72.71±6.821)20 nmol/L OA 組 5 0.273±0.023 53.22±4.481)與正常組比較,1)P＜0.05

3 討 論

神經(jīng)元纖維纏結(jié)是AD的特征性病理改變之一,由高度磷酸化的tau蛋白組成。生理條件下,蛋白磷酸酶(主要是PP2A)與蛋白激酶調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化水平,使之處于低水平磷酸化的動態(tài)平衡[6]。有研究報道,AD病人腦中PP2A活性降低30%左右,PP2A活性降低是導(dǎo)致AD病人tau蛋白過度磷酸化的主要原因[7]。OA是一種特異性的PP2A抑制劑,在體內(nèi)或體外條件下,OA可使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白tau過度磷酸化,進(jìn)而使tau蛋白結(jié)合組裝微管的生物學(xué)功能降低而致微管解聚。由于微管在神經(jīng)細(xì)胞的軸漿運(yùn)輸、極性維持等生理活動中具有重要作用,所以,tau蛋白過度磷酸化會嚴(yán)重阻礙細(xì)胞的正常生理功能,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞退化[8,9]。據(jù)報道,在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中加入OA,可以引起 tau蛋白的異常過度磷酸化[10],另外,還有研究顯示,在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元、小腦顆粒細(xì)胞和Neuro-2a成神經(jīng)瘤細(xì)胞中加入OA 24 h后,檢測LDH顯著升高,M TT也顯示細(xì)胞活力明顯降低[11-13]。本實驗結(jié)果也顯示,在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中加入OA后,LDH增加,MT T的活力顯著降低,本研究僅觀察了OA對于培養(yǎng)神經(jīng)元所產(chǎn)生的毒性作用,其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

[1]Tatsch MF,Bottino CM,Azevedo D,et al.Neuropsychiatric symptoms in Alzheimer's disease and cognitively impaired,nondemented elderly from a community-based sample in Brazil:Prevalence and relationship with dementia severity[J].Am J Geriatr Psychiatry,2006,14(5):438-451.

[2]Kawasumi M,Hashimoto Y,Chiba T,et al.M olecular mechanisms for neuronal cell death by Alzheimer's amyloid precursor protein2relevant insults[J].Neurosignals,2002,11(5):236-250.

[3]Fernandez JJ,Candenas M L,Souto ML,et al.Okadaic acid,useful tool for studying cellular processes[J].Curr Med Chem,2002,9(2):229-262.

[4]Ling qiang Zhu,Yangyang Yin,Jianzhi Wang.Effect of L-carnitine on tau hyperphosphorylation and spatial memory deficit induced by okadaic acid in rats[J].Alzheimer's and Dementia,2009,5(4):395-396.

[5]Baig S,van Helmond Z,Love S.Tau hyperphosphory lation affects Smad 2/3 translocation[J].Neuroscience,2009,163(2):561-570.

[6]Iqbal K,Grundke-Iqbal I.Pharmacological approaches of neurofibrillary degeneration[J].Curr Alzheimer Res,2005,2(3):335-341.

[7]Kins S,Crameri A,Evans DR,et al.Reduced protein phos-phatase 2A activity induces hyperphosphorylation and altered compartmentalization of tau in transgenic mice[J].J Biol Chem,2001,276(41):38193-38200.

[8]Yoon S,Choi J,Haam J,et al.Reduction of mint-1,mint-2,and APP over expression in Okadaic acid-treated neurons[J].Neuroreport,2007,18(18):1879-1883.

[9]Yoon S,Choi J,Huh JW,et al.Calpain activation in Okadaic acid induced neurodegeneration[J].Neuroreport,2006,17(7):689-692.

[10]Kim D,Koh WK,Kim JU,et al.Okadaic acid-induced upregulation of nitrotyrosine and heme oxygenase-1 in rat cortical neuron cultures[J].Neurosci Lett,2001,297(1):33-36.

[11]Chen LQ,Wei JS,Lei ZN,et al.Induction of Bcl-2 and Bax was related to hyperphos phory lation of tau and neuronal death induced by okadaic acid in rat brain[J].Anat Rec A Discov M ol Cell Evol Biol,2005,287(2):1236-1245.

[12]Furukawa K,D'souza I,Crudder CH,et al.Proapoptotic effects of tau mutations in chromosome 17 frontotemporal dementia and Parkinsonism[J].Neuroreport,2000,11(1):57-60.

[13]Furukawa K,Mattson MP.Taxol stabilizes[Ca2+]i and protects hippocampal neurons against ex citotoxicity[J].Brain Res,1995,689(1):141-146.