體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞移植對頸動脈損傷后局部NO含量和eNOS mRNA表達的影響1)

趙然尊,石 蓓,郭 艷,許官學(xué),王冬梅,沈長銀

再狹窄是臨床冠心病介入治療后較嚴(yán)重的遠(yuǎn)期并發(fā)癥?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),再狹窄的病理機制包括早期內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管彈性回縮和平滑肌細(xì)胞的遷移與增殖、新生內(nèi)膜增生及晚期血管重塑?，F(xiàn)階段藥物洗脫支架治療可明顯抑制平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜的增生,降低了再狹窄發(fā)生率;然而,支架植入術(shù)可引起不同程度的血管壁損傷,并因此加重局部炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致更嚴(yán)重的內(nèi)皮功能障礙和新生內(nèi)膜增生等病理損傷修復(fù)反應(yīng)。近年研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有促進損傷動脈內(nèi)皮修復(fù)和抑制新生內(nèi)膜增生的作用[1]。但正常個體外周血循環(huán)中MSCs含量極少,動脈損傷后其上述作用效應(yīng)較弱,不足以阻斷再狹窄的發(fā)生。本研究在建立兔頸動脈粥樣硬化狹窄基礎(chǔ)上行球囊損傷,經(jīng)靜脈移植自體間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察其對粥樣硬化頸動脈球囊損傷后再內(nèi)皮化和內(nèi)膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 頸動脈粥樣硬化模型制備 選用健康純種大白兔為研究對象,體重2.0 kg±0.5 kg,雌雄不限(均購自第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心)。大白兔采用經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)2個月后,制作頸動脈粥樣硬化模型,具體制作步驟:以25%烏拉坦1 g/kg耳緣靜脈麻醉。無菌條件下,于兔頸前正中皮膚切開3 cm～4 cm的縱切口,充分分離顯露右頸外動脈,將右頸外動脈固定于自制的有機玻璃血管槽中,動脈兩端以橡皮筋拉緊阻斷血流。10 mL注射器內(nèi)裝生理鹽水,接4.5號頭皮針,平行于血管縱軸方向穿刺阻斷血管的一端進入血管內(nèi),充盈血管。另一端用4.5號頭皮針穿刺進入血管,生理鹽水沖洗置換處血管腔內(nèi)的血液后,空氣置換出血管內(nèi)生理鹽水。接上流量150mL/min的醫(yī)用氮氣氣流,歷時15 min造成內(nèi)皮干燥,內(nèi)膜損傷。然后生理鹽水置換出血管腔內(nèi)的氣體,放開動脈兩端橡皮筋恢復(fù)血流,壓迫穿刺點4 min～5 min止血,縫合皮下組織和皮膚并包扎?？傆嬐瓿?8只動物模型,隨機分為兩組,MSCs移植組(n=30)即于球囊損傷后即刻、1周和2周時給予MSCs經(jīng)耳緣靜脈移植;對照組(n=18)于球囊損傷后相同時間點給予等量生理鹽水注射。

1.2 MSCs來源與體外培養(yǎng) MSCs移植組所有動物于球囊損傷前1個月皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF,商品名:賽強,長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn))25 μ g/kg,連續(xù) 5 d后,然后采集外周血2次～3次,采用密度梯度離心法并貼壁培養(yǎng)法,分離培養(yǎng)獲得MSCs,經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原,一般認(rèn)為,MSCs均一表達CD44陽性,而 CD34、CD45陰性(USBiological公司,USA),且要求純度達95%以上。

1.3 MSCs靜脈移植 培養(yǎng)的MSCs制成細(xì)胞懸液,經(jīng)鑒定細(xì)胞濃度達到108/50 μ L。MSCs移植組于球囊擴張后即刻、1周和2周時經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射MSCs懸液每次約2 mL。

1.4 損傷動脈病理形態(tài)學(xué)測定 兩組動物均于術(shù)后4周處死,取出球囊損傷的頸動脈約2.0 cm,置于4%多聚甲醛溶液中固定,24 h后常規(guī)乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,然后每份標(biāo)本橫斷面非連續(xù)取4處切片,切片厚度 5 μ m,經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)法染色由計算機圖像分析儀分析測定下述指標(biāo):新近內(nèi)膜面積(NEA)、中膜面積(M A)、計算內(nèi)膜/中膜面積比(I/M)。指標(biāo)界定如下:新近內(nèi)膜面積即血管腔表面與內(nèi)彈力膜之間的面積;中膜面積即內(nèi)彈力膜與外彈力膜之間的面積;內(nèi)膜/中膜面積比即新近內(nèi)膜面積/中膜面積。

1.5 損傷動脈細(xì)胞增殖程度檢測 免疫組織化學(xué)染色測定增殖細(xì)胞核抗原(PCNA):采用鏈霉親和素-生物素過氧化物酶復(fù)合物(SABC)法,嚴(yán)格按照試劑盒(購自上海源葉生物科技有限公司)操作步驟進,染色陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕褐色,400倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)10個視野內(nèi)的細(xì)胞總數(shù),表達指數(shù)用百分比表示。

1.6 損傷動脈局部NO含量測定及eNOS mRNA檢測 NO含量采用ELISA法測定,嚴(yán)格按照試劑盒(購自上海晶天生物科技有限公司)操作規(guī)程進行。利用 RT-PCR檢測eNOS mRNA表達。根據(jù)文獻報道,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。eNOS(599bp)引物序列為:上游:5'-GCCGGATCCTCCAGG AGGGTGTCCACCTG-3',下游:5'-CCGGAATTCGAATACCAGCCTGATCCATGGAA-3'。 以 β-action(540bp)作為內(nèi)參物,上游:5'-GTGGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3',下游:5'-CTCTT TGATGTCA CGCACGATT TC-3'。PCR條件為:94℃1 min,68℃1 min,72℃3 min,首次循環(huán)94℃3 min,共35個循環(huán),結(jié)束前72℃25 min,以充分延伸。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,溴乙啶染色45 min,反射紫外燈下攝片,光密度掃描,以β-action光密度值作為內(nèi)參照物,eNOS表達量用二者光密度比值表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件,組間比較用方差分析,兩兩比較采用SNK檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FACS鑒定外周血分離培養(yǎng)的M SCs(見圖 1) 可見MSCs均一表達CD44陽性而CD34、CD45陰性,且純度達95%以上。

圖1 FACS檢測MSCs細(xì)胞表面抗原標(biāo)記

2.2 頸動脈病理形態(tài)學(xué)檢查 正常情況下,頸動脈內(nèi)皮光滑,內(nèi)皮細(xì)胞飽滿,呈長梭形,長軸與血流方向一致。球囊損傷后4周病理切片掃描電鏡觀察顯示,對照組見頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞缺失,部分內(nèi)皮片狀剝脫,局部有微血栓形成,動脈管壁全周明顯增厚,管腔狹窄較明顯,內(nèi)膜管腔面可見纖維組織增生形成纖維帽,纖維帽下中膜內(nèi)可見較多的泡沫細(xì)胞沉積,并伴有淡紅染無定形物質(zhì)形成,呈動脈粥樣硬化中晚期(纖維斑塊-粥樣斑塊期)改變;MSCs移植組頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞少量缺失,但無內(nèi)皮的片狀剝脫,管壁部分區(qū)域輕度增厚,管腔輕度狹窄,增厚處中膜可見少量泡沫細(xì)胞沉積,部分區(qū)域伴少量纖維組織增生,呈動脈粥樣硬化早中期(脂紋-纖維斑塊期)改變。

2.3 新生內(nèi)膜及中膜面積測定 與對照組相比較,MSCs移植組新生內(nèi)膜面積(NEA)和中膜面積(MA)均明顯減少(P＜0.05),而兩組間新生內(nèi)膜/中膜面積比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 MSCs移植組和對照組新生內(nèi)膜與中膜面積比較(±s)

表1 MSCs移植組和對照組新生內(nèi)膜與中膜面積比較(±s)

組別 n NEA(mm2) M A(mm2) I/M MSCs移植組 30 0.336±0.018 0.245±0.017 1.371±0.158對照組 18 0.845±0.0461)0.551±0.0241)1.534±0.014與對照組相比較,1)P＜0.05

2.4 細(xì)胞增殖程度測定 MSCs移植組細(xì)胞核增殖抗原PCNA陽性細(xì)胞率顯著低于對照組[(0.236±0.014)%vs(0.881±0.017)%,P＜0.05]。

2.5 損傷動脈NO含量及eNOS mRNA表達(見表2) MSCs移植組NO含量和eNOS mRNA表達均明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時,eNOS mRNA表達程度與4周時動脈內(nèi)膜增生情況相關(guān)分析顯示呈負(fù)相關(guān)(r=0.943,P＜0.05)。詳見表 2。

表2 損傷動脈NO含量及eNOS mRNA表達(±s)

表2 損傷動脈NO含量及eNOS mRNA表達(±s)

組別 n NO含量μ mol/gprot eNOS mRNA%M SCs移植組 30 0.984±0.027 0.871±0.024對照組 18 0.305±0.019 0.291±0.032 P＜0.05 ＜0.05

3 討 論

冠心病是嚴(yán)重威脅中老年健康的常見疾病,PCI手術(shù)作為冠狀動脈血運重建的有效手段,有效地解決血管狹窄,緩解心肌缺血導(dǎo)致的心絞痛等癥狀。然而,球囊擴張及支架植入均可不同程度地造成了血管內(nèi)膜損傷和撕裂,加重局部炎癥反應(yīng),導(dǎo)致嚴(yán)重的內(nèi)皮功能障礙,進而引起一系列級聯(lián)反應(yīng)包括平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及新近內(nèi)膜增生等病理損傷修復(fù)反應(yīng),最終導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生?；A(chǔ)研究表明,MSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)能夠向心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等方向分化[1-4]。Silva等[5]將標(biāo)記的MSCs經(jīng)心肌注射給慢性心肌缺血的犬模型,發(fā)現(xiàn)缺血心肌毛細(xì)血管密度增加,免疫染色顯示增加的毛細(xì)血管被覆標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞,證明MSCs有能力分化為內(nèi)皮細(xì)胞,促進血管再內(nèi)皮化[6,7]。但MSCs在正常人外周循環(huán)中含量極少,這種有益的作用不足對抗由于球囊擴張或支架植入引起的內(nèi)皮損傷和內(nèi)膜反應(yīng)性增生。

血管內(nèi)膜損傷后愈合過程包括內(nèi)膜撕裂激活血小板和白細(xì)胞黏附聚集,釋放出大量趨化因子和促有絲分裂因子,進而導(dǎo)致中膜平滑肌細(xì)胞增生、遷移至內(nèi)膜形成新生內(nèi)膜,最終細(xì)胞外基質(zhì)合成增加,基質(zhì)沉積增加,導(dǎo)致新生內(nèi)膜面積擴大。本研究采用經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)結(jié)合氮氣損傷制作頸動脈粥樣硬化大白兔模型,在此基礎(chǔ)上給予球囊損傷。細(xì)胞移植4周后病理形態(tài)學(xué)檢查顯示,MSCs移植組頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞少量缺失,但無內(nèi)皮的片狀剝脫,管壁部分區(qū)域輕度增厚,管腔輕度狹窄,增厚處中膜可見少量泡沫細(xì)胞沉積,部分區(qū)域伴少量纖維組織增生,呈動脈粥樣硬化早中期(脂紋-纖維斑塊期)改變;而對照組見頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞缺失,部分內(nèi)皮片狀剝脫,局部有微血栓形成,動脈管壁全周明顯增厚,管腔狹窄較明顯,內(nèi)膜管腔面可見纖維組織增生形成纖維帽,纖維帽下中膜內(nèi)可見較多的泡沫細(xì)胞沉積,并伴有淡紅染無定形物質(zhì)形成,呈動脈粥樣硬化中晚期(纖維斑塊-粥樣斑塊期)改變。上述研究結(jié)果提示,在損傷血管的病理修復(fù)的過程中MSCs移植可能發(fā)揮了有益作用。

本研究通過計算機軟件分析系統(tǒng)測量了頸動脈新生內(nèi)膜和中膜面積,結(jié)果顯示,與對照組相比較,MSCs移植組新生內(nèi)膜面積和中膜面積均明顯減少(P＜0.05);雖然兩組間新生內(nèi)膜面積/中膜面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但與MSCs移植組相比,對照組新生內(nèi)膜增生程度更為明顯。同時血管壁PCNA測定顯示MSCs移植組細(xì)胞核增殖抗原陽性細(xì)胞率顯著低于對照組,提示MSCs移植治療可能顯著抑制了新生內(nèi)膜增生,其在降低損傷動脈壁的細(xì)胞增殖和內(nèi)皮修復(fù)中可能發(fā)揮重要作用,其機制可能與靜脈移植的MSCs歸巢至球囊損傷的頸動脈,促進內(nèi)皮再生,降低局部炎癥反應(yīng)等有關(guān);而內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)能夠有效地抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜增生,從而降低再狹窄的發(fā)生[8-10]。此外,移植MSCs的旁分泌機制如分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在抑制局部炎癥反應(yīng)、促進血管生成等方面的有益作用亦可能參與了內(nèi)皮的修復(fù)[11]。

一氧化氮是一種小分子的活性物質(zhì),在心血管系統(tǒng)中,NO在維持血管張力的恒定和調(diào)節(jié)血壓的穩(wěn)定性中起著重要作用,是血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用的重要分子。同時,NO還可抑制平滑肌細(xì)胞激活分裂,作用于許多環(huán)節(jié)促進凋亡,抑制平滑肌細(xì)胞的遷移與增殖。本研究發(fā)現(xiàn),MSCs移植組mRNA表達均明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時,eNOS mRNA表達程度與4周時動脈內(nèi)膜增生情況相關(guān)分析顯示呈負(fù)相關(guān)。這提示,MSCs移植治療后新生內(nèi)膜增生程度降低可能部分與移植的MSCs重建內(nèi)皮功能,從而抑制平滑肌細(xì)胞遷移和增殖有關(guān)。

總之,本研究通過構(gòu)建接近于臨床上冠心病病變后的支架植入治療模式的大白兔模型,采用MSCs靜脈移植治療,發(fā)現(xiàn)其可明顯降低球囊損傷后的粥樣硬化頸動脈的新生內(nèi)膜增生,并在一定程度上促進內(nèi)皮再生和修復(fù),其機制部分與移植的MSCs重建內(nèi)皮功能有關(guān)。此研究結(jié)果對臨床上血管成形術(shù)后防治再狹窄的防治提供了重要的動物實驗數(shù)據(jù)。

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