細胞代數(shù)與5-氮胞苷濃度對體外誘導骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞定向分化的影響1)

王 寧,李新華,邢萬紅,陳 平

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞[1],它廣泛存在于成體器官和結締組織中[2],最早發(fā)現(xiàn)于骨髓[3]。骨髓來源的間充質干細胞是一種比較原始的骨髓基質細胞,被稱為骨髓間充質干細胞/祖細胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs),也被稱為骨髓來源的多潛能基質細胞[4]。自從Wakitani等報道MSCs可以分化為心肌細胞,M angi等[5]報道MSCs可以修復損傷的心臟以來,MSCs成為心臟修復和心肌組織工程種子細胞最熱門的候選來源。但其骨髓中的含量很低,僅占骨髓中單個核細胞的1/106～1/105。細胞在擴增過程中保持多潛能性,但該能力會隨著過度擴增和不恰當操作而減弱[4],因此本實驗探討大鼠MSCs細胞代數(shù)對增值與誘導分化能力的影響,及在能獲得充足細胞數(shù)量的同時,又不減弱細胞多潛能性的最佳時期。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 清潔級雄性SD大鼠,4周齡,體重100 g～120 g,由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。胎牛血清(美國HyClone公司);5-氮胞苷(5-Azα,美國 Sigma公司);噻唑蘭(M TT,美國Sigma公司);一抗:兔抗鼠cT nT抗體(上海藍基生物科技有限公司),兔抗鼠α-action抗體(上海藍基生物科技有限公司);過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素染色試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)。

1.2 大鼠骨髓間充質干細胞的分離和培養(yǎng) CO2窒息處死動物,無菌條件下取大鼠股骨和脛骨,以完全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔。按照1:1的比例將上述細胞懸液緩慢滴加到密度為1.077 g/mL的Percoll分離液上層,1 500 r/min離心30 min。吸取上、中層液面間的乳白色云霧狀的單個核細胞層,加入完全培養(yǎng)液重懸,離心洗滌2次。加入培養(yǎng)液以2×105/cm2～3×105/cm2

細胞密度接種于細胞培養(yǎng)瓶,置于37℃,5%CO2,飽和濕度的孵箱內培養(yǎng) 72 h換液,達60%～70%融合狀態(tài),傳代培養(yǎng)。

1.3 各代大鼠骨髓間充質干細胞增殖率測定及體外誘導 取第2代MSCs,消化后調整細胞懸液濃度至3×104/mL,接種于7個96孔板,每孔加入200 L,設調零孔5個。5%CO2,37℃孵育4 h待細胞貼壁。于貼壁后每天各取一板,每孔加入20 μ L M TT溶液(5 mg/mL,即 0.5%M TT),37℃繼續(xù)孵育4 h后吸取孔內上清液棄去。每孔加入150μ L二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使紫色結晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長下測量各孔的吸光值(OD值),記錄結果。選取第2代、第 6代、第10代 MSCs以3×104/mL細胞密度分別接種于96孔板,每代種植3板,貼壁12 h。每板分為4組,每組23孔,余4孔為調零孔。每板取3組為誘導組,分別以含 5μ mol/L、10μ mol/L 、15μ mol/L 5-氮胞苷的完全培液孵育24h,對照組每板23孔以完全培液孵育24 h,后改用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d。采用 MTT法,測取誘導后各代細胞第 1天、第3天、第5天的OD值。同時取第2代、第 6代、第10代細胞,以含5 μ mol/L、10μ mol/L、15 μ mol/L 5-氮胞苷的完全培養(yǎng)液誘導 24 h后,培養(yǎng)4周,并設未誘導組為陰性對照。

1.4 細胞形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)學變化和生長情況。

1.5 心肌特異性蛋白cTnT、α-Actin的檢測 將誘導培養(yǎng)4周的第2代、第6代、第10代細胞玻片,PBS清洗后4%多聚甲醛室溫固定 30 min。蒸餾水沖洗 3次,每次3 min。3%H2O2去離子水孵育5 min～10 min。滴加山羊血清室溫孵育10 min,傾去勿洗。滴加適當比例稀釋的一抗,4℃過夜。PBS清洗,3 min×3次;滴加生物素化二抗工作液(IgG/Bio),37℃孵育10 min。PBS清洗,3 min×3次;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育10 min。PBS清洗,3 min×3次;DAB顯色。沖洗、復染、脫水、透明、封片。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對樣本資料進行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用方差分析,組間兩兩比較進行SNK法檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)和形態(tài)學觀察 通過密度梯度離心法獲得的MSCs,接種于完全培養(yǎng)基中,48 h呈現(xiàn)為短紡錘、三角形短小細胞,細胞折光性好,可見黏附于細胞表面的Percoll顆粒。72 h成為細長紡錘、細長梭形細胞。第4天,細胞開始增殖,伴有較多的折光雙聯(lián)體,并形成小島狀克隆,細胞密度較低時,細胞排列不規(guī)則,可見三角形細胞。7 d～10 d可達70%～80%融合狀,細胞排列開始規(guī)整,呈束狀、旋渦狀或魚群狀。細胞傳至第2代,細胞形態(tài)趨于一致,細胞呈成纖維細胞樣。傳至第6代,可見少量圓形扁平細胞,約占細胞總數(shù)的5%,并隨細胞傳代次數(shù)的增加,有所增加但不明顯。此類細胞的增殖和克隆能力明顯低于紡錘樣成纖維樣細胞。

2.2 MSCs的體外誘導分化 各代細胞經(jīng) 5μ mol/L、10 μ mol/L、1 5μ mol/L5-Azα誘導液分別誘導24h,細胞均有死亡,且隨藥物濃度的升高細胞死亡率升高,但細胞代數(shù)對細胞的死亡率影響不明顯。細胞誘導24 h,貼壁的部分細胞變扁平或呈短棒狀。3 d后存活細胞開始增殖,細胞呈細長梭形,少數(shù)細胞呈三角形或多邊形。培養(yǎng)4周后,80%～90%細胞呈肌纖維狀,少數(shù)細胞為三角、多邊形或鋪路石狀,細胞出現(xiàn)聚集狀生長。不同代數(shù)細胞經(jīng)不同濃度5-氮胞苷誘導四周后均未見自發(fā)性搏動。

2.3 細胞生長狀況及增殖率測定 MSCs傳代培養(yǎng)潛伏期約1 d～2 d,第3天進入對數(shù)增殖期,第6天～第7天進入平臺期。不同濃度5-氮胞苷誘導的各代MSCs,通過MT T檢測,顯示誘導后的第2代MSCs增殖能力優(yōu)于第6代和第10代細胞,第6代與第10代MSCs增殖能力無統(tǒng)計學意義。未經(jīng)5-氮胞苷誘導的對照組顯示,第2代與第6代細胞增殖能力無統(tǒng)計學意義,均優(yōu)于第10代細胞。藥物對細胞增殖能力有一定影響,但隨細胞代數(shù)的增加其影響有減弱的趨勢;藥物濃度對細胞增殖能力的影響無統(tǒng)計學意義。詳見表1。

表1 相同濃度5-Aza誘導后第2代、第6代、第10代MSCs及對照組第5天增值率(±s)

表1 相同濃度5-Aza誘導后第2代、第6代、第10代MSCs及對照組第5天增值率(±s)

細胞代數(shù) 對照組 5 μ mol/L 10 μ mol/L 15 μ mol/L第2代 0.44±0.23 0.53±0.28 0.77±0.283)4) 0.89±0.283)4)第6代 0.42±0.25 0.03±0.201) 0.06±0.131)3) 0.04±0.201)3)第10代 0.26±0.191)2) 0.15±0.241) 0.19±0.201) 0.13±0.181)與第2代比較,1)P＜0.05;與第6代比較,2)P＜0.05;與對照組比較,3)P＜0.05;與5 μ mol/L比較,4)P＜0.05

2.4 心肌特異性肌鈣蛋白cTnT的檢測 以三種不同濃度5-Aza體外誘導四周的第2代、第6代、第10代BM-MSCs進行細胞免疫化學檢測 cTnT、α-Actin表達,各誘導組均表達陽性。說明經(jīng)三種濃度5-Aza誘導后的第2代、第6代、第10代BM-MSCs已向心肌定向誘導轉化,并表達心肌特異性蛋白。

3 討 論

骨髓間充質干細胞是一種比較原始的骨髓基質細胞,因其具有自我更新、擴增和多向分化潛能,在適宜條件下可被誘導分化為多種組織細胞[6],能夠分泌多種細胞因子,支持組織再生和修復,獲取途徑便利,易體外培養(yǎng)擴增,回植無免疫排斥反應,對組織損傷小等優(yōu)點[1,4],使得科學家們開始廣泛關注MSCs在組織修復和基因治療中的臨床應用。因其具有心肌和血管修復潛能的優(yōu)點[2],已成為心肌組織工程研究中種子細胞來源的熱點之一。但MSCs在骨髓中的含量很低,細胞培養(yǎng)接近高密度時,細胞進入平臺期,由紡錘體樣形態(tài)轉變?yōu)檩^大較平的表型[7],細胞的增殖與分化能力可能受到影響。在治療心肌損傷的疾病時,無論是采用經(jīng)外周靜脈、冠脈、心內膜及心外膜注射等途徑,還是進行心肌組織工程構建,首先需要有足夠的細胞數(shù)量和良好的細胞分化能力,因此如何獲得充足細胞數(shù)量,同時保持細胞良好的增殖分化能力,成為合理應用MSCs的前提。

能否實現(xiàn)MSCs在體外既保持良好的增殖分化能力又保持多潛能分化能力?李克等[8]將攜帶人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)目的基因的質粒通過脂質體轉染法轉入人骨髓MSCs中,顯示外源性hTERT基因可以在人骨髓 MSCs中獲得異位表達,并能誘導人骨髓MSCs的端粒酶活性,使人骨髓間質干細胞的壽命明顯延長而且不影響其維持干細胞的多向分化潛能特性。徐燕等[9]通過攜帶人端粒酶逆轉錄酶目的基因的反轉錄病毒質粒轉染人骨髓MSCs,達到了相似的效果。張海紅等[10]通過促紅細胞生成素與 MSCs共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)MSCs的增殖指數(shù)明顯增加,促紅細胞生成素呈時間、劑量依賴性促進MSCs增殖。亦有通過堿性成纖維細胞生長因子,中藥提取物等促進MSCs增殖的報道。實驗發(fā)現(xiàn)細胞傳代次數(shù)對細胞數(shù)量、增殖能力、分化能力和純度均有影響。相同藥物濃度誘導后的第2代細胞增殖能力優(yōu)第6代、第10代細胞,第6代、第 10代細胞增殖率無統(tǒng)計學意義。不同藥物濃度誘導的同代細胞間增殖能力無統(tǒng)計學意義。隨著細胞代數(shù)的增加,藥物濃度對細胞的增殖能力影響越來越小。經(jīng)5-氮胞苷誘導的BMSCs表達心肌特異蛋白cTnT、α-Actin,未經(jīng)誘導的BMSCs不表達心肌特異蛋白。錢海燕等[11]研究表明,第 10代MSCs經(jīng)5-氮胞苷誘導后心肌特異性蛋白的表達率明顯高于第1代、第4代、第8代細胞。由此推之,在增殖能力相同的情況下,細胞代數(shù)越高,越有利于細胞數(shù)量和誘導分化能力的提高,越有利于細胞移植、組織構建、臨床應用中對細胞數(shù)量和時間的要求。但細胞增殖能力的強弱與誘導率的高低是否存在一定關系,增殖能力與誘導率何者更有利于修復壞死的心肌還有待進一步研究。

[1]趙春華.干細胞原理、技術與臨床[M].北京:化學工業(yè)出版社,2006:63.

[2]Peter JP,Andrew CWZ,Stephen GW,et al.Concise review:Mesenchymal stromal cells:Potential for cardiovascular repair[J].Stem Cell,2008,26:2201-2210.

[3]裴雪濤.干細胞實驗指南[M].北京:科學出版社,2006:83.

[4]弗雷謝尼.人干細胞培養(yǎng)[M].章靜波,陳實平,譯.北京:科學出版社,2009:189.

[5]Mangi AA,Noiseux N,Kong D,Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and resto re performance of infarcted hearts[J].Nat Med,2003,9:1195-1201.

[6]Pittenger MF,Mackay SC,Beck RK,et al.Craig Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cell[J].Science,1999,284:143-147.

[7]Sekiya I,Larson BL,Smith JR,et al.Ex pansion of human adult stem cells from bone marrow stroma:Conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality[J].Stem Cells,2002,20:530-541.

[8]李克,劉瑞敏,韓雪飛,等.端粒酶逆轉錄酶基因修飾人骨髓間質干細胞的實驗研究[J].中國病理生理雜志,2007,23(7):1357-1362.

[9]徐燕,馮麗娜,唐琪,等.外源性端粒酶催化亞基不影響人骨髓間充質干細胞的特性[J].解剖學報,2008,39(6):836-840.

[10]張海紅,侯相麟,王小蕊.促紅細胞生成素對人骨髓間充質干細胞增殖和細胞周期的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復,2008,12(29):5671-5674.

[11]錢海燕.豬骨髓干細胞體外分化和優(yōu)化移植治療急性心肌梗死的實驗研究[D].中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學博士研究生學位論文,2007:36-37.