頭低位預(yù)置誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受的研究

羅 偉,蘇 海,李菊香,肖魯閩

199 0 年Kita-gawa等[1]用沙土鼠全腦缺血模型,發(fā)現(xiàn)沙土鼠預(yù)先短暫的缺血可誘導(dǎo)腦缺血耐受,可對(duì)抗隨后而來(lái)的腦組織的致死性缺血性損傷,由此激發(fā)了腦缺血耐受的大量研究。但大多數(shù)預(yù)置方式在技術(shù)上操作相對(duì)復(fù)雜,或副反應(yīng)較大。因此,需要從新的角度研究,尋找更簡(jiǎn)單易行的預(yù)處理方法。頭低位傾斜臥床(head-down tilt bed rest,HDT)是理療科常用的輔助治療措施,方法簡(jiǎn)便,易于操作。其是否可作為一種腦缺血耐受預(yù)置方法,目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道,這也正是本實(shí)驗(yàn)的研究主旨所在。

1 材料與方法

1.1 頭低位預(yù)置方式的建立 采用尾懸吊大鼠頭低位[2],從大鼠尾巴根部起,按縱向走行,將一長(zhǎng)約6 cm,與尾部等寬的醫(yī)用膠布條,粘貼于尾部皮膚表面兩側(cè),并連續(xù)纏繞一層1.5 cm寬的紗布條以對(duì)縱行膠布加強(qiáng)固定,然后在上面纏繞2圈～3圈0.8 cm寬的醫(yī)用膠布條,懸吊于籠頂,調(diào)整好長(zhǎng)度使大鼠后肢在伸直時(shí)剛好不能觸及籠的底部,從而使大鼠始終保持成頭低位(約-30°)。大鼠借前肢在籠內(nèi)自由活動(dòng),自由進(jìn)食。

1.2 局灶性腦缺血模型的制作[3]健康雄性Sprague-Dawley大鼠 21只,體重280 g～320 g(江西醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供),按隨機(jī)化原則平均分為H組、D組、C組,以本研究室的成熟技術(shù),將三組大鼠以腔內(nèi)線栓法制成永久性大腦中動(dòng)脈梗死模型。大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,背位固定,在氣管旁右側(cè)分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈靠近分叉處剪一0.2 mm小切口,將直徑為0.205 mm單尼龍線(一端加熱使之成光滑球面)插入頸內(nèi)動(dòng)脈,到達(dá)一定長(zhǎng)度(約18 mm～20 mm)后,會(huì)感到有阻力。此時(shí)說(shuō)明線的遠(yuǎn)端已經(jīng)到達(dá)大腦中動(dòng)脈。清醒后,大鼠出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體癱瘓癥狀,以前肢體為甚,表明模型制備成功。其中H組在造模前連續(xù)頭低位預(yù)置7 d,D組在造模前用復(fù)方丹參滴丸3丸溶于2 mL葡萄糖溶液中灌胃,每天1次,也連續(xù)7d,C組不進(jìn)行預(yù)處理。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能缺損體征評(píng)分 參考Bederson等[4,5]的方法在術(shù)后 4 h、8 h、24 h進(jìn)行5分制評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分,無(wú)神經(jīng)功能缺陷;1分,不能完全伸展病灶對(duì)側(cè)前爪;2分,向病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,向病灶對(duì)側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,伴有意識(shí)障礙。

1.3.2 四氮唑(T TC)染色及腦梗死灶測(cè)量 缺血24 h后立即斷頭,剪開(kāi)顱骨,取出大腦,將整個(gè)大腦在冠狀面均勻切成1.5 cm厚的腦片,共6片,行TTC染色。紅色為正常腦組織,白色為梗死區(qū)。用數(shù)碼相機(jī)微距攝片,輸入電腦,用圖像處理軟件(photoshop7.0.1)計(jì)算梗死體積。為了抵消個(gè)體差異,計(jì)算每只大鼠梗死體積占整個(gè)大腦體積的百分比[6]。

1.3.3 組織學(xué)觀察 大鼠腦冠狀切片拍片后,對(duì)第2張和倒數(shù)第2張腦片石蠟包埋,HE染色,光鏡觀察。

1.3.4 缺血區(qū)損傷神經(jīng)元的半定量分析 這兩張腦片對(duì)應(yīng)于《大鼠腦立體定向圖譜》中大鼠前囟前 1.2 mm、前囟后3.4 mm兩個(gè)冠狀切面,分別對(duì)海馬CA1區(qū)和頂葉皮層2個(gè)腦區(qū)進(jìn)行缺血性損傷的組織學(xué)半定量分析。每個(gè)腦區(qū)任取5個(gè)視野,神經(jīng)元損害程度為損傷神經(jīng)元占整個(gè)腦區(qū)的比率,分4級(jí):0級(jí),無(wú)神經(jīng)元損傷;1級(jí),神經(jīng)元損傷不到10%;2級(jí),神經(jīng)元損傷10%～50%;3級(jí),神經(jīng)元損傷超過(guò)50%。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后4 h、8 h、24 h神經(jīng)功能評(píng)分 MCAO 后,大鼠均表現(xiàn)出不同程度的對(duì)側(cè)(左邊)肢體癱瘓癥狀,尤以左前肢為重,大多表現(xiàn)為提起尾部后左前肢不能外展,呈屈曲內(nèi)收。參考Bederson和Menzise的評(píng)分方法,多數(shù)大鼠MCAO后為1級(jí)。詳見(jiàn)表1。

表1 術(shù)后4 h、8 h、24 h神經(jīng)功能評(píng)分 只

2.2 腦梗死灶測(cè)量結(jié)果 實(shí)驗(yàn)大鼠MCAO 24 h后,腦組織大體標(biāo)本可見(jiàn)缺血側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)出現(xiàn)相對(duì)于對(duì)側(cè)蒼白的梗死區(qū),缺血側(cè)M CA及其分支擴(kuò)張淤血,缺血側(cè)半球較對(duì)側(cè)腫大。經(jīng)TTC染色,梗死灶為白色,正常腦組織為紅色,兩者界限清晰可辨。各腦片出現(xiàn)大小相對(duì)不等的梗死灶,梗死范圍多以第3層、第4層腦片為明顯。詳見(jiàn)表2。

表2 各組腦梗死范圍的比較(±s)

表2 各組腦梗死范圍的比較(±s)

組別 鼠數(shù)只梗死體積mm3大腦體積mm3梗死體積/大腦體積%H組 7 169.39±37.001) 1 300.06±236.07 13.03±1.961)D組 7 185.66±33.641) 1 227.30±145.75 15.13±2.171)C組 7 294.94±63.39 1 148.83±226.73 25.72±2.86與C組比較,1)P＜0.05

2.3 壞死細(xì)胞觀察 HE染色:細(xì)胞呈固縮、嗜伊紅性改變的為紅色神經(jīng)元,完全失去細(xì)胞核結(jié)構(gòu)者為鬼影細(xì)胞,兩者皆為壞死細(xì)胞特征。光鏡下病灶中心呈篩網(wǎng)狀,病灶周邊可見(jiàn)較多的紅色神經(jīng)元核鬼影細(xì)胞,同時(shí)可見(jiàn)固縮、水腫大的神經(jīng)細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),微血管內(nèi)可見(jiàn)血栓形成。

2.4 缺血區(qū)神經(jīng)元損傷程度的半定量分析 本實(shí)驗(yàn)還觀測(cè)了大鼠2個(gè)不同區(qū)域的神經(jīng)元損傷情況,來(lái)評(píng)估頭低位的腦保護(hù)作用。H組和D組中,海馬CA1區(qū)、頂葉皮層的神經(jīng)元損傷程度均有明顯減輕。詳見(jiàn)表3。

表3 缺血區(qū)神經(jīng)元損傷程度的半定量分析 只

3 討 論

腦缺血損傷?？芍虏煌潭鹊纳窠?jīng)功能障礙,嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量,甚至危及生命。長(zhǎng)期以來(lái),人們一直努力尋找安全有效的藥物及措施以減輕腦缺血損傷。早在1986年Murry等[7]就在犬心肌缺血模型中發(fā)現(xiàn)了缺血預(yù)處理和缺血耐受現(xiàn)象。1990年Kitagawa等[1]證實(shí)該現(xiàn)象同樣存在于大腦,隨后更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了缺血耐受現(xiàn)象的器官普遍性。隨著研究的深入,腦缺血預(yù)處理的概念逐漸拓展,預(yù)處理的方法不再僅限于腦缺血,而是涵蓋了許多“亞毒性”的侵害性物質(zhì)或措施。有關(guān)預(yù)處理機(jī)制的研究也成為當(dāng)前的熱點(diǎn)之一。

頭低位傾斜臥床是一種被廣泛采用的地面模擬太空失重的研究方法。目前開(kāi)始在臨床(理療科)用作為一種防治腦部疾病等的治療手段,但其作用機(jī)制卻不是很清楚。有研究表明頭低位時(shí)流體靜水壓消失,約有2 000 mL血液由下肢轉(zhuǎn)移到上身,其中20%左右分布到頭部,引起腦循環(huán)的改變。Kawai等[8]比較了8名被試者坐位、平臥位和頭低位-6°時(shí)腦中動(dòng)脈的血流速度。與坐位相比,平臥位和頭低位時(shí)腦血流速度分別增加111%和114%,而與平臥位相比,頭低位時(shí)無(wú)明顯變化。頭低位時(shí)腦灌注壓和顱內(nèi)壓的增高及整個(gè)血循環(huán)狀態(tài)的改變對(duì)腦循環(huán)產(chǎn)生一定影響。猴-6°頭低位7 d和19 d后,腦質(zhì)量增加13%,腦中動(dòng)脈、小動(dòng)脈、靜脈、毛細(xì)血管和軟腦膜持久性充血,管壁通透性異常,血管周圍水腫,有少量血細(xì)胞滲出[9];兔-20°頭低位第3天出現(xiàn)毛細(xì)血管緊密連接受損,內(nèi)皮細(xì)胞壁出現(xiàn)皺褶、失去完整性和光滑性,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)飲泡增加,周細(xì)胞內(nèi)溶酶體增多及毛細(xì)血管萎縮[10]。在顯微切片中可見(jiàn)紅細(xì)胞游出血管壁外。本實(shí)驗(yàn)采用尾懸吊大鼠頭低位的預(yù)置方法,研究對(duì)永久性腦缺血的影響。在懸吊期間可見(jiàn)大鼠頭、面部及頸部腫脹,部分大鼠眼結(jié)膜嚴(yán)重充血,表明體液向上身轉(zhuǎn)移明顯。

本研究首次應(yīng)用改進(jìn)的線栓法MCAO模型研究了大鼠頭低位預(yù)置7 d對(duì)永久性腦梗死的影響,結(jié)果顯示頭低位組和藥物組均產(chǎn)生明顯的腦保護(hù)作用。單從神經(jīng)功能損害評(píng)分的結(jié)果來(lái)看,術(shù)后8 h開(kāi)始,頭低位組和藥物組均可以明顯改善大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù),但是術(shù)后4 h則沒(méi)有明顯改善,可能有以下幾個(gè)原因:①麻醉藥物的作用還沒(méi)有完全消失,造成觀察大鼠神經(jīng)功能時(shí)產(chǎn)生假象;②術(shù)后腦組織正處于較嚴(yán)重的缺血損傷狀態(tài),頭低位的腦保護(hù)作用不足以有效地糾正這種情況;③頭低位的腦保護(hù)作用不是在短期內(nèi)立刻發(fā)揮作用的,而是相對(duì)緩慢,但是持續(xù)地發(fā)揮腦保護(hù)作用。

本研究認(rèn)為,頭低位預(yù)置對(duì)隨后永久性腦缺血產(chǎn)生了保護(hù)作用,表現(xiàn)在神經(jīng)功能損害減輕和梗死范圍減少,梗死周邊神經(jīng)元損害程度減輕等多方面。通過(guò)相關(guān)分析研究發(fā)現(xiàn),術(shù)后神經(jīng)功能、腦梗死體積和神經(jīng)元損傷程度之間具有明顯相關(guān)性,也即:神經(jīng)元損傷程度越小,腦梗死體積越小,術(shù)后神經(jīng)功能的改善也就越好,但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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