超微六味地黃湯對(duì)孕期被動(dòng)吸煙胎鼠腦抗氧化能力的影響1)

屈 波,蔡光先,劉柏炎,潘小平,何澤云

腦發(fā)育過程中存在著大量神經(jīng)元的增殖以及凋亡。許多因子參與此過程。臨床調(diào)查研究表明,被動(dòng)吸煙者胎兒會(huì)出現(xiàn)發(fā)育遲緩,表現(xiàn)為體格發(fā)育緩慢,而且可能伴隨智力發(fā)育低下,如弱智、多動(dòng)癥等。Kelsey等[1]調(diào)查研究顯示,孕婦吸煙者所生嬰兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形的發(fā)生率增高。給大鼠注射尼古丁溶解液成功地制備出致畸模型,并證實(shí)尼古丁是一種神經(jīng)致畸劑。我國吸煙人數(shù)為3.5億,居世界各國之首,女性吸煙率并不高,但由于男性吸煙率居高不下,超過一半的婦女每日生活在二手煙霧環(huán)境中,成為被動(dòng)吸煙的主要受害人群。因此有必要深入探討香煙對(duì)發(fā)育中腦的影響以及相關(guān)的防治藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)ICR小鼠50只,雄性25只,體重22 g～25 g;雌性25只,體重20 g～22 g,由上海西普爾-比凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證:2003—002。

1.1.2 藥物 六味地黃湯處方來源于《小兒藥證直訣》,組成:熟地黃240 g,山萸肉120 g,山藥120 g,澤瀉90 g,牡丹皮90 g,茯苓90 g。藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科,經(jīng)鑒定符合2005年《藥典》標(biāo)準(zhǔn)。超微粉制備由湖南省中醫(yī)藥研究院湖南省超微工程技術(shù)中心參考有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制備[2]。

分別稱取傳統(tǒng)六味地黃湯120 g和超微六味地黃湯120 g(其比例如處方)。傳統(tǒng)飲片按《藥典》要求煎煮,取兩次煎液混合,水浴蒸發(fā)濃縮為含生藥2.0 g/mL。超微飲片按照標(biāo)準(zhǔn)浸泡法[3],即第1次加90℃10倍于藥材的水,第2次加90℃5倍于藥材的水,各浸泡20 min后,取濾液,用定量濾紙過濾,合并濾液,水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥1.5 g/mL。

1.1.3 試劑 芙蓉牌香煙(烤煙型,焦油含量 15 mg,一氧化碳13 mg,煙堿1.0 mg),常德卷煙廠;考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒由南京建成生物有限公司提供。

1.1.4 儀器 WFZ75紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司),北京醫(yī)療器械廠GSY型恒溫水浴鍋;哈爾濱GK2-80振動(dòng)超微粉碎機(jī);貝克曼低溫高速離心機(jī);湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心被動(dòng)吸煙裝置。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥 孕鼠隨機(jī)分為5組,每組10只。正常對(duì)照組(A組);模型組(B組):孕第 7天開始熏煙;超微六味地黃湯全量組(C組)、超微六味地黃湯 1/3量組(D組)、傳統(tǒng)六味地黃湯組(E組):孕第7天開始熏煙灌胃。所有動(dòng)物于孕19 d處死。正常對(duì)照組動(dòng)物不被動(dòng)吸煙,不做任何處理,與其他組飼養(yǎng)條件相同。根據(jù)課題組前期的工作,C組灌服超微六味地黃湯浸膏27.3 g/kg,每日1次;D組灌服超微六味地黃湯浸膏9.1 g/kg,每日1次;E組灌服六味地黃湯浸膏 27.3 g/kg,每日1次。所有動(dòng)物灌液量均為0.5 mL。模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.2 動(dòng)物模型復(fù)制 動(dòng)物于18:00時(shí)按雌雄2:1合籠,次日8:30取出雌鼠,發(fā)現(xiàn)陰道栓者確定孕期為0.5 d,記為E0.5。造模按文獻(xiàn)的方法采用被動(dòng)吸煙法[4],于E7～E10,將小鼠置于特制的密閉容器中(10 L),每天熏煙4次,每次15 min,每只小鼠每次燃燒香煙1.5支,兩次間隔為 3 h;至E11～E18,每只小鼠燃燒香煙2支,間隔時(shí)間和持續(xù)時(shí)間同前。

1.2.3 取材和標(biāo)本處理 各組孕鼠E19取材。10%水合氯醛腹腔麻醉,剪開腹腔,暴露子宮,從游離端分離子宮,取出胚胎,0.01 mol/L PBS沖洗血污。胎鼠取全腦,按照重量體積比用生理鹽水制備成10%腦組織勻漿液,4℃3 000 r/min離心10 min后取上清液備用。

1.2.4 SOD和MDA檢測 嚴(yán)格按照試劑盒方法操作。在550 nm波長條件下用分光光度計(jì)測定其OD值(光密度),并計(jì)算SOD的活性:SOD[U/(mg?prot)]=(OD對(duì)照管-OD測定管)/OD對(duì)照管÷50%×反應(yīng)液總量/取樣量÷蛋白含量。在532 nm波長處測定其OD值(光密度),再按下式求出MDA生成量:M DA[nmol/(mg?prot)]=(OD測定管-OD空白管)/(OD標(biāo)準(zhǔn)管-OD標(biāo)準(zhǔn)空白管)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷蛋白含量。

2 結(jié) 果

SOD:與A組相比,B組胎鼠腦SOD下降不明顯(P＞0.05),治療后C組較B組、E組明顯升高(P＜0.05)。MDA:與A組相比,B組胎鼠腦MDA明顯升高(P＜0.05);治療后各組MDA均有所下降,C組MDA明顯低于B組和D組(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組胎鼠腦組織SOD和MDA比較(±s)

表1 各組胎鼠腦組織SOD和MDA比較(±s)

組別 SOD[U/(mg?prot)]MDA[nmol/(mg?prot)]A組 12.228±4.113 0.257±0.149 B組 7.019±2.899 0.684±0.2321)C組 17.450±6.0572)4) 0.153±0.0702)3)D組 10.561±3.468 0.343±0.134 E組 8.888±1.809 0.320±0.165與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05;與D組比較,3)P＜0.05;與E組比較,4)P＜0.05

3 討 論

香煙煙霧中的氧自由基可誘導(dǎo)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、蛋白質(zhì)交聯(lián)和凝集。胚胎組織富含多不飽和脂肪酸,極易受到氧自由基的氧化損傷引起細(xì)胞凋亡。脂質(zhì)過氧化物可引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯著升高,激活凋亡有關(guān)的蛋白(如蛋白磷酸酯堿酶、鈣神經(jīng)堿等),導(dǎo)致 Bax升高,Bcl-2下調(diào),從而誘導(dǎo)凋亡。香煙煙霧損傷胚胎腦神經(jīng)元細(xì)胞的線粒體,導(dǎo)致線粒體內(nèi)、外膜間的促凋亡因子細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子釋放至胞漿中,通過一系列反應(yīng)激活Caspase蛋白,引起細(xì)胞凋亡。六味地黃湯能降低Caspase-3的活化并抑制Bax升高,阻止凋亡的發(fā)生。

中醫(yī)理論認(rèn)為生長發(fā)育、生殖和機(jī)體盛衰均由腎氣盛衰所主導(dǎo)。腎為先天之本,腎精是構(gòu)成人體的基本物質(zhì),為生長發(fā)育提供原動(dòng)力。腦為髓海,屬于奇恒之腑,為元神之所居。腎與腦的關(guān)系為“腎生髓,通于腦”,因此,腎在腦的發(fā)育中起著決定性的作用。腎之精氣的盛衰直接關(guān)系到腦髓的盈虧及大腦功能的正常發(fā)揮。腎中精氣不足,髓海失養(yǎng)就會(huì)形成健忘失眠,反應(yīng)遲鈍,頭暈?zāi)垦?記憶力減退等髓海不足的病理變化,六味地黃丸可以改善上述病變。說明腎和腦之間有著密切的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度反證了這一論斷。

課題組前期的研究已證實(shí):孕鼠被動(dòng)吸煙可造成胎鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞層次不清,神經(jīng)元凋亡增多,皮層神經(jīng)元數(shù)量減少,顯示腦發(fā)育不良,六味地黃湯傳統(tǒng)飲片能有效改善上述表現(xiàn)[5]。本研究進(jìn)一步表明:被動(dòng)吸煙鼠仔腦組織中 Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)增加,六味地黃湯超微和傳統(tǒng)飲片均能抑制Caspase-3的活化和Bax升高;超微六味地黃湯全量組和超微六味地黃湯1/3劑量組對(duì)Caspase-3的效果優(yōu)于傳統(tǒng)六味地黃湯組。

[1]Kelsey JL,Theodors RH,Bracken MB.Maternal smoking and congenital malfo rmations:An epidemiological study[J].J Epidem Community Health,1978,32:103.

[2]蔡光先,楊永華,張水寒.微粉化對(duì)人參類藥材有效成分的影響[J].中國醫(yī)藥學(xué)報(bào),2001,16(6):26.

[3]蔡光先,楊永華,陳燕軍,等.銀翹解毒湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片的化學(xué)對(duì)比研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2002,8(6):5.

[4]張秀泉,嚴(yán)雋鴻,洪素英,等.被動(dòng)吸煙法建立IUGR動(dòng)物模型[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1993,13(4):314-317.

[5]蔡光先,劉柏炎,陳奕安.六味地黃湯對(duì)宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎鼠腦發(fā)育的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2007,22(9):642-644.