活血開竅法對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織興奮性氨基酸的影響

張青萍,劉 泰,譚璐璐,梁麗英

腦缺血時缺血神經(jīng)元大量釋放興奮性氨基酸(EAA)對神經(jīng)元的損傷起著關鍵作用。適量的興奮性氨基酸對于維持細胞的正常生理活動是必需的,但胞外興奮性氨基酸濃度過高則會產生毒性,導致神經(jīng)元損傷[1]?；钛_竅法是治療腦梗死的常用方法之一,以往實驗研究表明,具有活血開竅作用的醒腦通脈膠囊(由田三七、膽南星、地龍、石菖蒲、冰片等組成)能提高血清超氧化物歧化酶(SOD)活力,清除機體自由基,減輕自由基對缺血腦組織的損傷;通過降低血栓素B2(TXB2)和增加前列環(huán)素(PGI2)的含量,使血管擴張,降低血小板聚集性,利于梗死灶的血液供應,對腦血栓形成療效可靠[2]。

本實驗采用改良線栓法[3]建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,觀察活血開竅法對腦損傷的保護作用及對腦組織谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)含量的影響,以期探討其治療缺血性腦血管病的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar雄性大鼠,體重 280 g～350 g,鼠齡4個月。由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號:SCXK桂 2003-0003,使用許可證號:SYXK桂2003-0005。

1.2 主要試劑和藥品 醒腦通脈膠囊由廣西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院制劑室制備,按一定比例制成膠囊,每克含生藥15 g;尼莫地平由山東新華制藥股份有限公司提供(國藥準字H10910080,產品批號0507132),每片20 mg;戊巴比妥鈉:中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司,批號:F20020915,SCRC69020180。氨基酸標準品、其他試劑皆為國產分析純試劑,由廣西分析測試研究中心(中國實驗室國家認可委員會認可實驗室)有機化學分析室提供。

1.3 主要實驗儀器 AR2140型電子分析天平,上海奧豪斯生產;5804R冷凍高速離心機,德國Centrifuge;L-8800全自動氨基酸分析儀,日本日立公司。手術器械:手術刀、手術剪、眼科剪、眼科鑷、手術鑷、止血鉗、持針鉗、動脈夾、三棱縫針、醫(yī)用絲線(黑色 0號,上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司,批號:12E081)、3-3.5號日本DUEL進口漁線。

1.4 方法

1.4.1 模型的制備及分組、給藥 25只大鼠隨機分為5組,每組5只,即正常組、腦缺血再灌注組、尼莫地平陽性對照組、醒腦通脈組(大小劑量共2組),其中除了正常組以外均制作成腦缺血2 h再灌注48 h的模型。采用線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞的局灶性腦缺血再灌注模型。正常組不造模;其余4組分別用2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉大鼠仰臥固定,頸部正中切口,鈍性分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈,仔細分離避免損傷迷走神經(jīng),并結扎頸總動脈、頸外動脈。在頸總動脈分叉處剪一小口,以尼龍線從頸總動脈分叉處插入,進入頸內動脈,當線栓進入約1.8 cm,有阻力時表明線栓已達大腦中動脈起始端,并阻斷大腦中動脈起始端及所有側支血流循環(huán),導致大腦中動脈局灶缺血,分別栓塞2 h后,輕輕回拉插線至頸總動脈切口處,制成再灌注模型,術后動物蘇醒后即行神經(jīng)功能缺失體征評分以評定模型成功與否。神經(jīng)功能缺失體征評分:采用Longa等[4]的方法在術后進行5級制評分。評分標準:1級(0分)無神經(jīng)缺損體征;2級(1分)不能充分屈曲對側前爪;3級(2分)向麻痹側轉;4級(3分)向麻痹側傾倒;5級(4分)不能自發(fā)行走,意識喪失。2級(1分)～4級(3分)為成功模型,計入實驗動物數(shù)。醒腦通脈膠囊治療組用蒸餾水把醒腦通脈膠囊備制成混懸液,按每次250 mg/kg(低劑量組),1 000 mg/kg(高劑量組)給藥,分別在造模前給藥2 d,每日 1次,在腦缺血2 h再灌注48 h后灌胃1次,腦缺血再灌注模型組給予生理鹽水灌胃,陽性對照組給予尼莫地平灌胃,按每次2 mg/kg給藥,給藥時間同醒腦通脈膠囊治療組。在腦缺血2 h再灌注48 h后灌胃1次后,約1 h處死大鼠,取腦檢測。

1.4.2 檢測方法 將大鼠斷頭取腦,去掉嗅球、小腦及低位腦干,快速取右側大腦半球額頂葉皮層大腦組織約0.3 g,加200 μ L PBS在冰臺上磨成勻漿,吸出勻漿液,在 18 000 r/min、4℃條件下離心20 min,取上清液加磺基水楊酸1:1沉淀,用孔徑0.45 μ m 水系濾膜過濾,取25 μ L過濾后上清液直接上機檢測氨基酸含量(高效液相色譜法)。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0版軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,各組間比較用one-way ANOVA 檢驗。

2 結 果

與正常組大鼠比較,模型組大鼠腦組織中Glu、Asp含量顯著升高(P＜0.01);與模型組大鼠比較,醒腦通脈大、小劑量組腦組織中Glu、Asp含量顯著降低;與尼莫地平組比較,醒腦通脈大劑量組腦組織中Glu、Asp含量顯著降低(P＜0.05或 P＜0.01)。說明醒腦通脈大、小劑量組均可降低腦組織中 Glu、Asp的含量,且具有量效關系。詳見表1。

表1 各組大鼠腦組織中Glu、A sp含量比較(±s)

表1 各組大鼠腦組織中Glu、A sp含量比較(±s)

組別 n Glu(μ g/mL) Asp(μ g/mL)正常組 5 39.00±10.391) 18.72±4.151)模型組 5 86.00±8.66 50.90±5.55尼莫地平組 5 68.72±8.901) 34.78±8.091)醒腦通脈大劑量組 5 54.94±2.051)2) 25.70±0.851)3)醒腦通脈小劑量組 5 74.42±9.331) 39.90±4.901)與模型組比較,1)P＜0.01;與尼莫地平組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 討 論

腦缺血損傷級聯(lián)反應分為4個階段,即興奮性毒性、梗死灶周圍去極化、炎癥和細胞程序性死亡,在缺血后不同的時間分別出現(xiàn),各階段互有重疊并非孤立存在[5]。興奮性毒性是指因興奮性氨基酸受體激活引起的神經(jīng)元細胞死亡[6]。級聯(lián)反應都以興奮性毒性開始,興奮性毒性也可能是所有下游事件的觸發(fā)者,可被看做是最重要的一個。由于其發(fā)生的時間極短(數(shù)分鐘至數(shù)小時),治療比較困難。腦缺血時,缺血神經(jīng)元大量釋放的EAA尤其是Glu對神經(jīng)元的損傷起關鍵作用。由于EAA使神經(jīng)元持續(xù)去極化,增加了神經(jīng)元內Glu等的大量釋放,又因腦缺血后三磷腺苷(ATP)降解,依賴能量而重吸收Glu的機制衰竭,影響Glu攝取功能,甚至出現(xiàn)Glu向細胞外液轉移,如此惡性循環(huán),突觸間隙持續(xù)高濃度的Glu就引起興奮性神經(jīng)毒性[7]。故拮抗EAA興奮性毒性,包括抑制其過度釋放,促進其再攝取,以及抑制其受體活性,對腦缺血損傷具有防治作用。

有些活血開竅中藥能影響級聯(lián)反應中的某一階段,同時還改善血液循環(huán)。馬麗焱等[8]報告葛根總黃酮、三七總皂苷、氧化苦參堿、小檗堿可增加腦局部血流量。對培養(yǎng)的神經(jīng)細胞,三七總皂苷能拮抗谷氨酸介導的興奮性毒性。三七總皂甙直接保護腦細胞、改善組織血液循環(huán)是其作用的基礎。醒腦通脈膠囊為活血開竅劑,功用活血化瘀祛痰,醒腦開竅通絡。三七及其主要成分具有收縮血管,促進凝血作用;能抑制血小板聚集,降低血液黏度,具有活血作用;能減輕局部腦缺血后腦水腫,縮小梗死范圍,因而具有抗腦缺血作用;現(xiàn)代藥理研究表明石菖蒲可以有效抑制腦缺血再灌注后腦中Glu、Asp及γ一氨基丁酸(GABA)含量的異常升高,從而減輕上述物質在腦缺血-再灌注時對神經(jīng)元的損害,進而起到腦保護的作用[9]。

本研究表明,缺血2 h再灌注48 h后,腦組織Glu和Asp含量明顯增加,表明EAA的興奮毒性參與了腦缺血后早期細胞損傷和遲發(fā)性神經(jīng)損傷的發(fā)生過程。在本研究中,活血開竅法之醒腦通脈膠囊治療組與缺血再灌注模型對照組比較,醒腦通脈膠囊能明顯降低腦組織Glu和Asp含量,與缺血再灌注模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),且具有量效關系。以上結果說明,活血開竅法可對抗缺血性腦損傷,防止再灌注時EAA的升高。提示活血開竅法抗缺血性腦損傷的作用機制可能與其對抗腦缺血再灌注后EAA的升高有關。

[1]趙剛,李樹清.興奮性氨基酸毒性與缺血性腦損傷[J].國外醫(yī)學:腦血管疾病分冊,2004,12(6):426.

[2]劉泰.自擬醒腦通脈膠囊治療急性腦血栓的研究[J].臨床薈萃,2000,15(19):867-868.

[3]羅勇,董為偉.Wistar大鼠插線法局灶性腦缺血/再灌注模型的實驗研究[J].重慶醫(yī)科大學學報,2002,27(1):124.

[4]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery:Occlusion without cranietomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[5]廖維靖,Frank W,Ulrich D.腦缺血損傷的病理生理機制-損傷級聯(lián)反應[J].國外醫(yī)學:腦血管疾病分冊,1998,6(4):197-202.

[6]Beal MF.Mechanisms of excitotoxicity in neurologic diseases[J].FASEB J,1992,6(15):3338-3344.

[7]陳維洲,芮耀誠.腦血管疾病基礎與臨床研究[M].濟南:山東科技出版社,1993:12-25.

[8]馬麗焱,肖培根,郭寶林,等.幾種中藥成分對腦組織的保護作用[J].中國中藥雜志,1999,24(4):238-239.

[9]柯雪紅,方永奇.石菖蒲揮發(fā)油對腦缺血-再灌注腦中氨基酸的影響[J].中華老年學雜志,2003,23(5):302-303.