黃芪多糖對兔動脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響

曾國安,陳玉燕,李 博,吳清華

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的顯著特點,急性冠脈綜合征及腦卒中患者體內(nèi)均有不同程度的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和損傷。在引起動脈粥樣硬化的眾多因素中,高膽固醇血癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)過強、免疫調(diào)節(jié)功能異常是三個不可缺少的重要危險因素。AS是以動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞遷移與增殖為主的病理改變,是導(dǎo)致冠脈事件、腦卒中事件等心腦血管疾病的直接原因[1]。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharids,APS)是從中藥黃芪中提取的有效活性成分,具有多種生物活性,以往的研究證實APS對心血管疾病有良好的預(yù)防作用,但其確切機制尚不完全清楚。本實驗依據(jù)APS抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[2],探討其對冠心病血管內(nèi)皮功能及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 新西蘭雄性兔40只,體重2.4 kg±0.3 kg,以普通飼料或高膽固醇飼料分籠喂養(yǎng),室溫18℃～22℃,自由攝食、飲水。

1.2 試劑與藥品 三酰甘油(TG)測定試劑盒(GPO-PAP法)、總膽固醇(TC)測定試劑盒(CHOD-PAP法)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒(磷鎢酸-鎂沉淀法):中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn);丙二醛(M DA)測定試劑盒(硫代巴比妥酸法)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(黃嘌呤氧化酶法)、一氧化氮(NO)測定試劑盒(硝酸還原酶法):南京建成生物工程研究所生產(chǎn);內(nèi)皮素-1(ET-1)測定試劑盒(放射免疫法):北京東亞免疫技術(shù)研究所生產(chǎn);C-反應(yīng)蛋白(CRP)測定試劑盒(膠乳比濁法):上海捷門生物技術(shù)合作公司生產(chǎn);卡托普利由上海華氏制藥有限公司生產(chǎn);黃芪多糖由美國泛華醫(yī)藥公司北京代表處提供。

1.3 模型制備 隨機將40只新西蘭雄性兔分為4組,每組各10只?？瞻捉M:正常顆粒飼料;其余3組從實驗第1天起給予高脂飼料,牛血清1 mL/kg從耳緣靜脈注射1次;黃芪多糖(APS)組:普通飼料加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的膽固醇喂養(yǎng),每天同時腹腔注射APS(500 mg/kg);卡托普利組:同時灌喂卡托普利(5 mg/kg),相當(dāng)于臨床劑量的5倍;空白組、模型對照組給予等體積的生理鹽水4 mL/kg;實驗周期10周。測血清TG、TC、HDL-C、NO、MDA和CRP濃度以及SOD活性,并測血漿ET-1濃度,計算斑塊面積。并作形態(tài)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 12.0軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗比較兩組均數(shù)間的差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組新西蘭兔空腹 TG、TC、HDL-C、斑場面積比較(見表1) 模型對照組、APS組與空白組相比,空腹TG、TC均明顯升高(P＜0.05);APS組與模型對照組相比,TG明顯下降(P＜0.01),而 TC無明顯變化(P＞0.05),說明APS能降低 TG,但對TC無降低作用。模型對照組、APS組與空白組相比,HDL-C均因TC的升高而代償性地升高(P＜0.05),但模型對照組、卡托普利組的HDL-C/TC顯著低于空白組(P＜0.05),說明此時HDL-C不能充分運輸外周 TC回肝臟代謝,而 APS組的HDL-C/TC的比值與空白組較為接近(P＞0.05);模型對照組與卡托普利組各項指標(biāo)無差異。APS組斑塊面積明顯低于模型對照組和卡托普利組(P＜0.01)。

表1 各組新西蘭兔空腹TG、TC、HDL-C比較(±s)

表1 各組新西蘭兔空腹TG、TC、HDL-C比較(±s)

組別 n TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL-C(mmol/L) HDL-C/TC(%) 斑塊面積(%)空白組 10 0.610±0.041 1.304±0.381 0.300±0.082 24.60±3.20 0模型對照組 10 4.056±0.3321) 34.501±1.2861) 4.349±0.7301) 12.50±1.74 62.10±5.701)卡托普利組 10 3.658±0.5281) 33.677±1.3741) 4.821±0.8101) 14.23±1.881) 58.03±2.301)APS組 10 0.774±0.0481)2) 34.228±1.2691) 7.081±0.6501)2) 20.57±1.302) 20.68±3.051)2)與空白組比較,1)P＜0.05;與模型對照組、卡托普利組比較,2)P＜0.01

2.2 各組新西蘭兔空腹血清MDA、NO、CRP、ET-1濃度及SOD活性(見表2) 模型對照組與空白組相比,空腹MDA、NO、CRP均明顯升高(P＜0.01);APS組與模型對照組相比,MDA、NO、CRP明顯下降(P＜0.05或 P＜0.01);同時,模型對照組SOD活性顯著下降(P＜0.01),但APS組SOD活性明顯高于模型對照組(P＜0.01)。模型對照組與空白組、APS組比較,ET-1濃度明顯升高;空白組與APS組比較,ET-1濃度無差異;模型對照組與卡托普利組各項指標(biāo)無差異。

表2 各組新西蘭兔空腹血清MDA、NO、CRP、ET-1濃度及SOD活性比較(±s)

表2 各組新西蘭兔空腹血清MDA、NO、CRP、ET-1濃度及SOD活性比較(±s)

組別 n SOD(U/mL) MDA(nmol/mL) NO(μ mol/L) CRP(mg/L) ET-1(pg/mL)空白組 10 1.228±0.081 2.430±0.200 2.828±0.505 2.703±1.303 472.00±26.01模型對照組 10 0.915±0.0801) 49.821±11.5031) 8.655±1.0611) 9.244±3.3511) 511.16±21.541)卡托普利組 10 0.954±0.0711) 36.150±17.1041) 7.617±1.2491) 6.451±2.7031) 505.23±25.091)APS組 10 1.167±0.0792) 4.851±0.7381)2) 5.729±0.4911)2) 4.705±2.2341)3) 478.21±28.983)與空白組比較,1)P＜0.01;與模型對照組、卡托普利組比較,2)P＜0.01;與模型對照組比較,3)P＜0.05

2.3 主動脈AS病理學(xué)觀察 對照組家兔主動脈內(nèi)膜光滑,未見斑塊形成。蘇丹IV染色后,模型對照組、卡托普利、APS組主動脈內(nèi)膜均有肉眼可以觀察到的不同程度的紅色斑塊,呈點、斑、條狀,有些融合成片,邊界清晰,突出于內(nèi)膜表面,但表面無明顯破潰,病變以主動脈弓處最為嚴(yán)重。光學(xué)顯微鏡下,正常主動脈壁內(nèi)皮完整無損傷;模型對照組血管內(nèi)粥樣硬化斑塊明顯向內(nèi)膜凸起,纖維帽下可見大量泡沫細(xì)胞和少量細(xì)胞碎片,斑塊處中膜平滑肌細(xì)胞受壓萎縮,可見平滑肌細(xì)胞增生;卡托普利組與模型對照組類似;APS組與模型對照組比較病變明顯減輕,出現(xiàn)少量的泡沫細(xì)胞。

3 討 論

AS的發(fā)病過程十分復(fù)雜,血漿中ET-1升高是AS快速進展的危險標(biāo)志[3]。本組實驗結(jié)果顯示,高脂飼料喂養(yǎng)新西蘭兔10周,血清 TG、TC、ET-1明顯升高,HDL-C/TC 明顯降低,說明HDL對膽固醇的清除能力降低,可引發(fā)類似人類AS的病變。病理學(xué)觀察,主動脈均形成明顯的脂質(zhì)斑塊和粥樣斑塊,證明了高脂血癥及 AS模型成功,APS組 TG、ET-1明顯降低,HDL-C/TC明顯升高,提示APS可干預(yù)AS的形成和發(fā)展?？ㄍ衅绽麨檠芫o張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑,可通過減少血管緊張素Ⅱ的生成和緩激肽的降解,增加NO的合成,保護血管內(nèi)皮細(xì)胞,已廣泛應(yīng)用于高血壓和心力衰竭的治療。高劑量卡托普利能防止高脂喂養(yǎng)的動物形成明顯的AS[4],而本組實驗使用15.0 mg/(kg?d),是人用劑量的6倍,結(jié)果顯示對AS的形成無防治作用,進一步證實卡托普利對AS形成的抑制作用與劑量有關(guān)。大量研究表明,脂質(zhì)過氧化是AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié),高脂血癥時,體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡遭到破壞[5],許多自由基清除劑如SOD活性降低,產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物(LPO)及其終產(chǎn)物MDA,LPO可直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞退行性變化和通透性增強,氧化修飾的低密度脂蛋白(ox-LDL)可促進單核細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞對 LDL的吞噬,減少膽固醇的清除,加速泡沫細(xì)胞的形成[6,7]。Bjorkerucl等的研究證明,ox-LDL能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoooeh musclecells,VSMC)凋亡、增殖與凋亡失衡,與AS及其并發(fā)癥的形成有關(guān)。本實驗觀察到,APS能明顯降低血清LPO,升高SOD活性,增強抗氧化能力,以及保護內(nèi)皮細(xì)胞的功能,從AS形態(tài)學(xué)進一步證實,APS能明顯減輕或減少粥樣斑塊的程度和面積,HE染色后光鏡觀察,內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞層數(shù)減少,平滑肌細(xì)胞增生減輕。炎癥學(xué)說與細(xì)胞凋亡是AS研究的新領(lǐng)域,相關(guān)文獻報道,AS病變中不僅含有大量的脂質(zhì),而且有大量炎癥細(xì)胞浸潤,且在AS發(fā)展的不同時期均有慢性炎癥反應(yīng)。有人發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者的外周血中含有炎性介質(zhì),如白介素-6(IL-6)、CRP,以及促炎性細(xì)胞因子白介素-1 β(L-1 β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)等濃度明顯升高,同時,ox-LDL能刺激T細(xì)胞,激活炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和血管壁細(xì)胞多種炎癥介質(zhì)的表達,這些因子將AS灶內(nèi)各種細(xì)胞間通過自分泌、旁分泌相互聯(lián)系、相互影響,使病變得以發(fā)展[1],而炎癥過程最具有標(biāo)志的因子是 CRP[8]。本組實驗結(jié)果顯示,AS模型組中 NO、CRP濃度升高,APS組NO、CRP濃度明顯降低。NO是血管內(nèi)皮舒張因子,具有擴張血管、抗血小板黏附聚集、抑制VSMC增殖等保護血管的作用,是生理狀態(tài)下對抗AS發(fā)生發(fā)展的重要因素。本組實驗中的AS模型為粥樣斑塊期,可見淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤,提示炎癥反應(yīng)的存在,在炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α等刺激下,誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達,產(chǎn)生大量NO,NO又與反應(yīng)產(chǎn)生ONOO-,后者釋放NO2、?OH,加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,促使AS發(fā)展[9,10],最近發(fā)現(xiàn)在正常血管和AS各階段的VSMC中都存在細(xì)胞凋亡,尤其在晚期則有大量細(xì)胞凋亡[11]。同時,ox-LDL、TNF-α等也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？傊?黃芪多糖可明顯降低血清中總膽固醇、三酰甘油、丙二醛和內(nèi)皮縮血管肽的含量,從而減輕內(nèi)皮縮血管肽對血管的損傷作用;同時升高一氧化氮、超氧化物歧化酶及總抗氧化活力。應(yīng)用黃芪多糖家兔光鏡下可見腹主動脈內(nèi)膜表面基本光滑,內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)基本完好,提示其具有較好的對抗氧化損傷和保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。本組實驗結(jié)果支持上述觀點,APS具有免疫調(diào)節(jié)作用,抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放,具有抗AS的作用,但詳細(xì)機制有待進一步證實[12]。

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