針刺對高脂大鼠主動(dòng)脈脂聯(lián)素受體基因表達(dá)的影響1)

袁愛紅,蔡 輝

脂聯(lián)素(adiponectin,APN)是白色脂肪組織分泌的細(xì)胞因子,對脈管系統(tǒng)有良性作用[1,2]。研究顯示,APN具有直接的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[3-8],對細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞間黏附分子-1和E選擇素等黏附分子的表達(dá)具有很強(qiáng)的抑制作用;能夠抑制巨噬細(xì)胞清道夫受體CA-1的表達(dá),導(dǎo)致巨噬細(xì)胞氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)吸收明顯降低、抑制泡沫細(xì)胞的形成[6];能夠削弱平滑肌細(xì)胞中生長因子誘導(dǎo)的DNA合成[7],造成通過ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制;APN的高聚體(HMW)形式通過激活A(yù)MPK能夠選擇性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[8]。APN與脂聯(lián)素受體(AdipoR)結(jié)合后發(fā)揮各項(xiàng)生理功能。研究發(fā)現(xiàn),AdipoR1和AdipoR2在同組織同影響條件下表達(dá)有不同。為了探討AdipoR不同亞型在高脂飲食機(jī)體主動(dòng)脈表達(dá)的變化以及針刺對該變化的影響,本研究采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測了高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠主動(dòng)脈AdipoR1和AdipoR2的基因表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 為剛斷乳的SD雄性大鼠26只,體重54 g～69 g,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號SYXK(蘇)2003-0032]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 所有SD大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,根據(jù)體重隨機(jī)分為自配方高脂飼料組(17只)和普通飼料組(對照組,9只),喂養(yǎng)12周后,空腹過夜,球后靜脈取血 3 mL,室溫靜置1 h后,3 000 r/min離心5 min,分離血清置-20℃冰箱保存,測血脂四項(xiàng)、一氧化氮(NO)和髓過氧化物酶(M PO)。然后根據(jù)體重將高脂飼料組大鼠隨機(jī)分為模型組(8只)和針刺組(9只),干預(yù) 4周。針刺組:選取后三里、內(nèi)庭、心俞三穴,進(jìn)針后,每穴快速行針1 min,后三里和內(nèi)庭接通G6805Ⅱ型電針儀連續(xù)波15 min,強(qiáng)度1 mA,頻率10 Hz。每次選取一側(cè)肢體,兩側(cè)輪流,周一到周六治療,周日休息,連續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均自由攝食飲水,每周測1次身長、體重。

1.3 觀察指標(biāo)和方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,禁食24 h,于次日8:00用20%氯胺酮,以1 mL/100 g劑量麻醉后,剪開胸腹腔,暴露心臟,心臟取血5 mL,血液樣品處理同上,然后于冰盤中分離主動(dòng)脈,置液氮中保存待測各項(xiàng)指標(biāo)。三酰甘油(TG)用TPO-PAP法,總膽固醇(TC)用CHOD-PAP法,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用選擇性沉淀法,NO用硝酸還原法,MPO用鄰連茴香胺法,主動(dòng)脈AdipoR1和AdipoR2基因檢測用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法。

1.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR步驟

1.4.1 RNA的提取 取主動(dòng)脈組織100 mg,加入1 mLTrizol

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 干預(yù)前后比較用配對樣本t檢驗(yàn),多組資料組間比較用單因素方差分析,方差齊性用 LSD,方差不齊用Games-Howell。統(tǒng)計(jì)軟件用SPSS 15.0,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。

2 結(jié) 果

2.1 針刺對高脂大鼠血脂的影響(見表1) 干預(yù)前,針刺組、模型組 TG、TC明顯高于對照組(P＜0.01),LDL-C高于對照組但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);模型組和針刺組TG、TC差異無統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。干預(yù)后,針刺組TG和TC明顯降低(P＜0.01),模型組、對照組干預(yù)前后TG和TC的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。試劑,室溫下形成Trizol與細(xì)胞的混合液。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)至離心管中,室溫下放置5 min;12 000 r/min 4℃離心10 min,將上清液移入新離心管。加入氯仿,上下振蕩15 s,溶液呈乳白狀,室溫靜置3 min;12 000 r/min 4℃離心15 min;將無色上清水相移至另一離心管;上清水相中加入等體積的異丙醇,輕輕混勻,室溫靜置10 min;12 000 r/min 4℃離心10 min;去上清,沿管壁加入1 mL 75%的乙醇(用DEPC處理過的水配制),輕輕混勻。12 000 r/min 4℃離心10 min;吸盡上清;室溫干燥沉淀2 min～ 5 min,加入 30 μ L～ 50 μL的無 RNase水溶解 RNA 沉淀。測定樣品在260 nm/280 nm的吸收值確定RNA的質(zhì)量。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄 每組份輕輕混勻,2 000 r/min離心20 s;取滅菌無核酸酶 0.2 mL PCR 管,依次加 入 2 μ g～ 5 μ g RNA 、Oligo dT(18)(10 μ mol/L)1 μ L、dNTPs(10 mmol/L)1 μ L 、無核 酸酶的雙蒸水至總體積 15.5 μ L;65℃保溫5 min,冰浴5 min;依次加入 RNase抑制劑 0.5 μ L、10×逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)Reaction Buffer 2 μ L、DTT 1μ L、AMV 1μ L,輕輕混勻后,2 000 r/min 離心20 s;37℃保溫1 h,70℃保溫15 min。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光PCR過程 一個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔,用Eppendorf移液器移至AXygen96孔板中;反應(yīng)體系為2X的RTmix 12.5μ L,模板(cDNA 稀釋 10 倍)1 μ L,引物 F 和 R 5 pmol/μ L mix 1 μ L,18.2 mΩ水 10.5 μ L,Total 25 μ L;PCR 程序?yàn)?95 ℃5 min,45cycle,94℃15 s,60℃30 s,95℃1 min,55℃1 min。

1.4.4 引物序列 AdipoR1:5'TGGGGAAAAAATTATGAACTGG 3',3'ACCCCTTT TTTAATACTTGACC 5';AdipoR2:5'AGTGATCCCTCATGATGTGCTG 3',3'TCACTAGGGAGTACTACACGAC5';內(nèi) 參:5'GCAGAAGGAGATCACAGCCCT 3',3'CGTCTTCCTCTAGTGACGGGA 5'。

表1 各組干預(yù)前后大鼠血脂水平(±s) mmol/L

表1 各組干預(yù)前后大鼠血脂水平(±s) mmol/L

組別 n TG TC HDL-C LDL-C對照組 干預(yù)前 9 0.929 0±0.049 9 1.830 7±0.075 4 1.061 4±0.056 1 0.195 3±0.017 0干預(yù)后 9 0.797 9±0.065 0 1.690 1±0.105 9 0.990 6±0.081 1 0.153 3±0.016 7模型組 干預(yù)前 8 1.915 1±0.161 91) 3.483 9±0.406 51) 1.599 4±0.258 0 0.581 5±0.173 0干預(yù)后 8 1.533 7±0.060 8 3.083 7±0.347 9 1.502 3±0.181 8 0.458 9±0.096 1針刺組 干預(yù)前 9 1.744 0±0.078 11) 3.297 5±0.25 21) 1.627 0±0.311 6 0.253 3±0.052 6干預(yù)后 9 1.004 5±0.061 72) 2.017 0±0.113 32) 1.222 9±0.117 2 0.196 1±0.062 5與對照組干預(yù)前比較,1)P＜0.01;與同組干預(yù)前比較,2)P＜0.01

2.2 針刺對血清NO和MPO的影響(見表2) 干預(yù)前,模型組和針刺組NO明顯低于對照組(P＜0.01),M PO明顯高于對照組(P＜0.05或P＜0.01),模型組和針刺組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。針刺后NO較前明顯增加,M PO較前明顯下降(P＜0.01),模型組干預(yù)前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 干預(yù)前后各組大鼠血清NO和MPO活力(±s)

表2 干預(yù)前后各組大鼠血清NO和MPO活力(±s)

組別 n NO(μ mol/L) MPO(U/L)對照組 干預(yù)前 9 23.076 9±1.138 7 42.281 2±2.549 4干預(yù)后 9 21.518 3±1.087 9 40.751 6±1.939 8模型組 干預(yù)前 8 13.579 6±1.124 72) 52.851 5±2.954 21)干預(yù)后 8 12.262 5±1.193 1 53.220 2±2.998 8針刺組 干預(yù)前 9 12.626 2±1.076 12) 51.677 1±1.538 32)干預(yù)后 9 17.345 4±1.805 23) 42.062 7±3.185 33)與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與同組干預(yù)前比較,3)P＜0.05

2.3 針刺對主動(dòng)脈AdipoR1和AdipoR2基因表達(dá)的影響(見表3) 針刺組、模型組AdipoR1、AdipoR2相對值低于對照組(P＜0.05或P＜0.01);針刺組AdipoR2相對值高于模型組(P＜0.05)。

表3 干預(yù)后各組大鼠主動(dòng)脈AdipoR1和Adipo R2基因表達(dá)(±s)

表3 干預(yù)后各組大鼠主動(dòng)脈AdipoR1和Adipo R2基因表達(dá)(±s)

組別 AdipoR1 mRNA AdipoR2 mRNA對照組 0.238 9±0.015 0 0.309 0±0.010 9模型組 0.060 8±0.001 31) 0.114 8±0.015 82)針刺組 0.088 6±0.014 52) 0.238 5±0.029 21)3)與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05

3 討 論

APN是聯(lián)系腹內(nèi)肥胖、代謝綜合征和心血管疾病的樞紐,同時(shí)也是脂肪細(xì)胞-血管調(diào)節(jié)軸上起關(guān)鍵作用的激素,與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。APN能夠抗血管生成[9]、抑制內(nèi)皮炎癥反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞增殖[6],具有直接抗動(dòng)脈硬化作用。目前對APN信號的研究是個(gè)熱點(diǎn)問題。AdipoR有AdipoR1和AdipoR2兩個(gè)亞型[10],兩者均為有7個(gè)跨膜區(qū)域的膜蛋白,有著相似的分子結(jié)構(gòu)。AdipoR1是球形APN的高親和力受體,對于骨骼肌的長形APN親和力低,AdipoR2是肝臟球形和長形高分子量APN的中等親和力受體。在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支所致心肌缺血的小鼠模型中,梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)左心室肌AdipoR1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低[11],AdipoR2表達(dá)無明顯變化。PPAR α和 PPARγ激動(dòng)劑可上調(diào) 3T3-L1脂肪細(xì)胞和參與動(dòng)脈粥樣硬化形成的單核巨噬細(xì)胞的AdipoR2表達(dá),對AdipoR 1表達(dá)無影響[12,13]。在非酒精性脂肪肝患者肝臟AdipoR2 mRNA水平顯著下調(diào),AdipoR1 mRNA表達(dá)無明顯變化[14]。

疾病過程中AdipoR含量上調(diào)或下調(diào)及其活化狀態(tài)改變均可以引起細(xì)胞對APN的敏感性變化,從而影響細(xì)胞的代謝及功能,成為促進(jìn)疾病發(fā)生與發(fā)展的重要機(jī)制之一。本研究顯示,高脂飲食飼養(yǎng)12周后,SD大鼠TG和TC明顯升高,發(fā)生了高脂血癥,血清中NO明顯降低,MPO明顯升高,血中NO濃度通常作為血管NO水平的標(biāo)志[15],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明高脂大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng),血管功能受損;氧化應(yīng)激是高脂造成血管內(nèi)皮損傷的一個(gè)重要機(jī)制,APN對氧化應(yīng)激具有抑制作用[16],反之,氧化應(yīng)激亦可抑制APN表達(dá)。干預(yù)4周后,模型組大鼠主動(dòng)脈AdipoR1和AdipoR2的基因表達(dá)明顯低于對照組,說明高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠主動(dòng)脈APN信號受損,APN對主動(dòng)脈的良性作用減弱;與模型組比較,針刺組大鼠TG、TC和MPO明顯降低,血清NO增加,主動(dòng)脈AdipoR2基因表達(dá)明顯上調(diào),AdipoR1基因表達(dá)無明顯變化,說明針刺具有一定的降血脂作用,與眾多文獻(xiàn)報(bào)道相符,同時(shí)針刺對于高脂機(jī)體血管功能的改善有一定的影響。此作用可能是通過針刺增加了主動(dòng)脈的APN信號實(shí)現(xiàn)的,針刺對主動(dòng)脈APN作用的改善可能是通過AdipoR2介導(dǎo)的。

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