淫羊藿總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠血清NO、MPO的影響1)

蔡 輝,郭郡浩,董曉蕾,蔡佳宇,趙智明

高膽固醇血癥和高三酰甘油血癥誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷,最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成,其高三酰甘油血癥引起血管損傷主要由于一氧化氮(NO)的生物利用度下降,出現(xiàn)氧化應(yīng)激[1],損傷內(nèi)皮細(xì)胞,加劇AS的炎性反應(yīng),激活轉(zhuǎn)錄因子κ B。髓過氧化物酶(MPO)水平與中性粒細(xì)胞激活程度之間存在極顯著的相關(guān)性,是中性粒細(xì)胞的活化標(biāo)志物,調(diào)節(jié)NO對(duì)血管信號(hào)傳遞和舒張的作用,直接改變血管的炎癥反應(yīng)性[2]。淫羊藿總黃酮為黃銅類化合物,其主要生物活性成分可改善內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化等功能[3],對(duì)心血管系統(tǒng)存在潛在保護(hù)作用。本文就淫羊藿總黃酮減輕主動(dòng)脈內(nèi)皮氧化應(yīng)激、炎癥損傷的作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為剛斷乳的SD雄性大鼠35只,平均體重60 g左右,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2003-0032;淫羊藿總黃酮由南京澤朗醫(yī)藥公司合成。

所有大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周,根據(jù)體重隨機(jī)分為配方高脂飼料(魚粉3%、豬油12%、白蔗糖 5%、雞蛋 10%、膽固醇 2%、膽酸鹽0.5%、甲基硫氧嘧啶0.2%和67.3%基礎(chǔ)飼料)組(26只)和普通飼料組(對(duì)照組,9只),高脂飲食組進(jìn)食量控制在15 g/100(g?d),第12周末從大鼠眶后靜脈抽血檢測(cè)血脂以確定模型是否復(fù)制成功。再將高脂飲食組大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為模型組(8只)和高脂飲食加100 mg/kg淫羊藿總黃酮組(低劑量淫羊藿總黃酮組,9只)、高脂飲食+200 mg/kg淫羊藿總黃酮組(高劑量淫羊藿總黃酮組,9只)。12周后給予連續(xù)灌胃,干預(yù)4周。對(duì)照組和模型組予相應(yīng)溶劑灌胃,均灌胃4周。藥物干預(yù)4周后處死大鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,禁食24 h,于次日08:00時(shí),用20%氯胺酮,以1 mL/100 g劑量麻醉后,剪開胸腹腔,暴露心臟,左心室穿刺取血5 mL,室溫靜置1 h后,3 000 r/min離心5 min,分離血清置-20℃冰箱保存,待測(cè)血清指標(biāo);于冰盤中分離主動(dòng)脈,置液氮中保存待測(cè)其他指標(biāo)。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.1 血脂和生化指標(biāo)檢測(cè) 三酰甘油(TG)用TPO-PAP法,總膽固醇(TC)用CHOD-PAP法,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用選擇性沉淀法,NO用硝酸還原法,MPO用鄰連茴香胺法,嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作,試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2.2 主動(dòng)脈病理檢測(cè) 大鼠主動(dòng)脈弓與胸主動(dòng)脈交界處取材,10%中性甲醛固定,石蠟包埋,水平橫切面制備石蠟切片,厚度4 μ m,蘇木素伊紅(HE)染色,100倍光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 多組資料組間比較用單因素方差分析,方差齊性用LSD,方差不齊用Dunnett T3。并統(tǒng)計(jì)正態(tài)性,統(tǒng)計(jì)軟件用SPSS13.0。統(tǒng)計(jì)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。

2 結(jié) 果

2.1 主動(dòng)脈病理 組織病理學(xué)改變光鏡下,對(duì)照組血管壁結(jié)構(gòu)清晰、內(nèi)皮細(xì)胞完整無脫落,內(nèi)膜薄,中層平滑肌層均勻、厚度正常,外層為疏松結(jié)締組織;高脂飲食組血管內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落,內(nèi)膜增厚,血管壁向管腔內(nèi)突出,可見中膜平滑肌增生、排列紊亂。而淫羊藿總黃酮小劑量組可見內(nèi)膜輕度增厚,未見明顯平滑肌增生。淫羊藿總黃酮大劑量組干預(yù)組沒有明顯的病理改變。

2.2 各組血脂水平 造模后12周后高脂飲食組 TG、TC、LDL-C較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。經(jīng)淫羊藿總黃酮干預(yù)后16周末,模型組TG、TC較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01),淫羊藿總黃酮組 TG、TC較模型組顯著下降(P＜0.05或P＜0.01),淫羊藿總黃酮大劑量組較小劑量組有明顯升高趨勢(shì);HDL-C各組未見明顯差異(P＞0.05),但淫羊藿總黃酮干預(yù)組有升高趨勢(shì);LDLC各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1、表2。

表1 干預(yù)前第12周各組血脂比較(±s) mmol/L

表1 干預(yù)前第12周各組血脂比較(±s) mmol/L

組別 n TG TC HDL-C LDL-C對(duì)照組 9 0.929±0.150 1.831±0.226 1.255±0.092 0.195±0.051高脂飲食組 26 1.740±0.4141) 3.503±1.0901) 1.334±0.213 0.452±0.3281)與對(duì)照組,1)P＜0.01

表2 各組干預(yù)后各組血脂比較(±s)mmol/L

表2 各組干預(yù)后各組血脂比較(±s)mmol/L

組別 n TG TC HDL-C LDL-C對(duì)照組 9 0.798±0.195 1.690±0.293 1.187±0.148 0.153±0.050模型組 8 1.533±0.1721) 3.084±0.9841) 1.168±0.065 0.244±0.132淫羊藿總黃酮大劑量組 9 0.937±0.3963) 1.478±0.3022) 1.121±0.145 0.144±0.099淫羊藿總黃酮大劑量組 9 1.006±0.4322) 1.816±0.3072) 1.132±0.153 0.206±0.241與對(duì)照組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.3 血清NO和MPO 模型組血清NO顯著低于對(duì)照組和淫羊藿總黃酮組(P＜0.05或P＜0.01),淫羊藿總黃酮大劑量組較小劑量組有升高趨勢(shì);模型組血清M PO明顯高于對(duì)照組(P＜0.01),淫羊藿總黃酮組較模型組明顯下降(P＜0.01),其中大劑量組下降趨勢(shì)明顯(P＜0.05)。詳見表3。

表3 干預(yù)后第16周各組血清NO含量和MPO活力

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是一個(gè)全球范圍內(nèi)的嚴(yán)重健康問題。高脂飲食為動(dòng)脈粥樣硬化獨(dú)立危險(xiǎn)因素,高脂飲食可增加的血漿膽固醇及低密度脂蛋白,對(duì)血管內(nèi)膜進(jìn)行功能性損傷,并加速動(dòng)脈粥樣硬化形成[4]。高脂血癥不僅是動(dòng)脈粥樣硬化的促發(fā)因素,而且貫穿其發(fā)生、發(fā)展的過程當(dāng)中[5]。本研究通過高脂飲食造成高脂血癥大鼠,模型組TG、TC、LDL較對(duì)照組明顯升高,主動(dòng)脈內(nèi)膜HE染色顯示內(nèi)皮細(xì)胞脫落、斷裂,平滑肌層增生。通過高脂飲食可誘導(dǎo)高脂血脂大鼠并出現(xiàn)主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷。給予淫羊藿總黃酮干預(yù)后 TG、TC較模型組下降,HDL有所升高,可降低LDL,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與文獻(xiàn)報(bào)道相符[6]。長期高脂飲食情況下增加的脂蛋白特別是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和膽固醇對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜造成功能性損傷,亦包括氧化應(yīng)激損傷,氧化應(yīng)激參與脂質(zhì)氧化損傷動(dòng)脈內(nèi)膜[7]。高脂血癥狀態(tài)下,血管內(nèi)皮中的巨噬細(xì)胞、炎性細(xì)胞聚集所釋放的超氧陰離子可加速 NO降解,影響 L-精氨酸轉(zhuǎn)化為 L-胍氨酸,使 NO生成減少,內(nèi)皮依賴性舒張功能調(diào)節(jié)失衡,血管張力增加,結(jié)構(gòu)重建,內(nèi)皮損傷。增加血管內(nèi)皮NO合成能力,提高NO介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能,來達(dá)到改善高脂血癥之血管內(nèi)皮舒張功能障礙。在高膽固醇血癥大鼠L-精氨酸可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能,抵抗動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[8]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組NO水平較對(duì)照組明顯下降,并且病理同時(shí)提示內(nèi)皮損傷較明顯,說明NO在維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性有著重要作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明通過提高血清NO水平可改善內(nèi)皮功能。

MPO為血紅素過氧化物酶超家族成員之一,是氧化應(yīng)激的一個(gè)主要標(biāo)志物。M PO水平與中性粒細(xì)胞激活程度之間存在極顯著的相關(guān)性,是中性粒細(xì)胞的活化標(biāo)志物,MPO還可以通過細(xì)胞信號(hào)通路將活化信號(hào)由胞漿傳遞至胞核內(nèi),誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的表達(dá),上調(diào)機(jī)體炎癥反應(yīng),促進(jìn)炎癥效應(yīng)細(xì)胞的增殖與活化,使效應(yīng)細(xì)胞更易于穿越內(nèi)皮屏障到達(dá)局部炎癥組織[2,9],易損斑塊形成的各個(gè)階段均與MPO有關(guān),是預(yù)測(cè)斑塊易損性的炎性標(biāo)志物。MPO催化過氧化氫和氯離子生成次氯酸,使LDL-C氧化成為ox-LDL,啟動(dòng) AS的發(fā)生,同時(shí),M PO促進(jìn)HDL-C的氧化,影響其膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)作用,參與AS的發(fā)生、發(fā)展。當(dāng)白細(xì)胞激活及脫顆粒時(shí),M PO被分泌到血管腔,結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞,隨后跨細(xì)胞運(yùn)動(dòng)到內(nèi)皮下基質(zhì),浸潤血管組織,直接消耗NO,從而影響NO信號(hào)傳導(dǎo),使血管內(nèi)皮舒張功能受損[10]。本研究中發(fā)現(xiàn),模型組MPO較正常組明顯增高,NO明顯下降,說明MPO可能存在通過消耗NO,加重血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。吡格列酮組干預(yù)4周后相比模型組M PO明顯下降,其內(nèi)皮相對(duì)高脂未見明顯損傷,內(nèi)皮比較完整,淫羊藿總黃酮改善內(nèi)皮細(xì)胞功能,抗氧化應(yīng)激,可能與升高NO,降低MPO有關(guān),其詳細(xì)機(jī)制尚不明確有待進(jìn)一步研究。

動(dòng)脈粥樣硬化形成早期與血脂、炎癥、氧化應(yīng)激、血小板活化、血栓形成密切相關(guān)。淫羊藿總黃酮抗炎、抗氧化應(yīng)激可能與TG、TC降低、NO升高、MPO降低有關(guān)。

[1]Bartus M,Lomnicka M,Lorkowska B,et al.Hypertriglyceridemia but not hypercholesterolemia induces endothelial dy sfunction in the rat[J].Pharmacol Rep,2005,57:127-137.

[2]Eiserich JP,Baldus S,Brennan M L,et al.Myeloperoxidase,a leukocyte-derived vascular NO oxidase[J].Science,2002,296(5577):2391-2394.

[3]Xu HB,Huang ZQ.Vasorelaxant effects of icariin on isolated canine coronary artery[J].J Cardiovasc Pharmacol,2007,49(4):207-213.

[4]Hanefeld M.The role of pioglitazone in modifying the atherogenic lipoprotein profile[J].Diabetes Obes Metab,2009,11(8):742-756.

[5]Blann AD,Seigneur M,Steiner M,et al.Circulating ICAM-1 and VCAM-1 in peripheral artery disease and hy percholesterolaemia relationship to the location of atherosclerotic disease,smoking,and in the prediction of adverse events[J].Thromb Haemost,1998,79(6):1080-1085.

[6]王茜,林煥冰,程玉芳,等.淫羊藿苷對(duì)高脂血癥大鼠粘附分子基因表達(dá)的影響[J].中國動(dòng)脈硬化雜志,2008,16(1):4-6.

[7]Victor VM,Rocha M,Sola E,et al.Oxidative stress,endothelial dysfunction and atherosclerosis[J].Curr Pharm Des,2009,15(26):2988-3002.

[8]Nematbakhsh M,Haghjooyjavanmard S,Mahmoodi F,et al.The prevention of endothelial dysfunction through endothelial cell apoptosis inhibition in a hy percholesterolemic rabbit model:The effect of L-arginine supplementation[J].Lipids Health Dis,2008,7:27.

[9]Wong ND,G ransar H,Narula J,et al.Myeloperoxidase,subclinical atherosclerosis,and cardiovascular disease events[J].JACC Cardiovasc Imaging,2009,2(9):1093-1099.

[10]Lau D,Baldus S.Myeloperoxidase and its contributory role in inflammatory vascular disease[J].Pharmacol T her,2006,111(1):16-26.