酵母提取液中谷胱甘肽定量測(cè)定方法的比較

李從軍，謝愛娣

1(湖北生物科技職業(yè)學(xué)院生物工程系，湖北武漢，430070)

2(湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院生化系，湖北武漢，430068)

酵母提取液中谷胱甘肽定量測(cè)定方法的比較

李從軍1，謝愛娣2

1(湖北生物科技職業(yè)學(xué)院生物工程系，湖北武漢，430070)

2(湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院生化系，湖北武漢，430068)

對(duì)ALLOXAN法、DTNB法和亞硝基鐵氰化鈉3種方法進(jìn)行了改進(jìn)與比較。結(jié)果表明，DTNB法用于酵母提取液中谷胱甘肽的測(cè)定具有顯著優(yōu)勢(shì)。研究了不同因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，得出了合適的測(cè)定條件。DTNB法準(zhǔn)確度和精確度良好，回收率和理論回收率無(wú)顯著差異，且添加甲醛后DTNB法能消除半胱氨酸的干擾，是一種低成本、簡(jiǎn)單、快速的用于酵母提取液中還原型谷胱甘肽測(cè)定的方法。

谷胱甘肽，測(cè)定，酵母提取液

谷胱甘肽(GSH)作為細(xì)胞內(nèi)唯一的含巰基的三肽在細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用[1］，在食品工業(yè)、醫(yī)藥臨床和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)上具有廣泛的應(yīng)用。目前谷胱甘肽的生產(chǎn)方法主要有萃取法、發(fā)酵法、酶法和化學(xué)合成法[2］。由于微生物發(fā)酵法與其他方法相比具有明顯的優(yōu)越性，是今后生產(chǎn)谷胱甘肽的主要趨勢(shì)，也是目前為止最具潛力的方法。而測(cè)定發(fā)酵提取液中谷胱甘肽是一個(gè)復(fù)雜的問題，谷胱甘肽穩(wěn)定性受到溫度和pH值等環(huán)境因素的限制。此外，生物樣品的組成往往十分復(fù)雜，其中包括各種蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽及其它非蛋白類物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)谷胱甘肽的測(cè)定常常有很大的影響。谷胱甘肽的這種不穩(wěn)定性以及生物樣品組成成分的復(fù)雜性使得它的檢測(cè)方法必須具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、穩(wěn)定的特點(diǎn)。

測(cè)定谷胱甘肽含量的方法有多種，主要包括碘量法、紙層析法、差熱分析法、高效液相色譜法、分光光度法、酶法、高效毛細(xì)管電泳法、熒光法等。分光光度法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高、不需要特殊的設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室得到了廣泛的應(yīng)用。本文改進(jìn)和比較了3種基于巰基反應(yīng)為原理的分光光度測(cè)定法，并對(duì)其測(cè)定條件進(jìn)行了詳細(xì)的研究，建立了一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的測(cè)定酵母提取液中谷胱甘肽含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母、甜酒酵母、啤酒酵母、安琪酵母、面包酵母、釀酒酵母，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 種子和發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO42 g/L，Mg-SO41 g/L，pH值自然。

1.1.3 GSH提取液的制備

采用溫差破碎法提取細(xì)胞內(nèi)的GSH。取酵母發(fā)酵液9 mL，4000 r/min離心5 min，收集菌體，加3 mL去離子水?dāng)嚢杈鶆颍?20℃冰凍過夜，沸水浴5 min，6000 r/min離心10 min，上清液即待測(cè)的GSH提取液。

1.2 主要試劑

GSH標(biāo)準(zhǔn)品;5，5＇-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(簡(jiǎn)稱DTNB);四氧嘧啶;亞硝基鐵氰化鈉;甘氨酸，半胱氨酸;Tris。

1.3 主要儀器

UV-240全波段掃描儀;UNICO UV-2100紫外可見分光光度計(jì);Anke TGL-16G高速冷凍離心機(jī);Mettler AE100分析天平;恒溫水浴鍋;控溫?fù)u床;微量移液槍。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 ALLOXAN試劑法

1.4.1.1 試劑

ALLOXAN試劑:稱取四氧嘧啶1.0 g，用 0 .1 mol/L的HCl溶液定容至1 L，低溫保存;0.1 mol/L甘氨酸溶液;0.24 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.6);200 mg/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液(蒸餾水配置，-80℃保存)。

1.4.1.2 操作步驟

[3］，改進(jìn)后按照表1進(jìn)行。

1.4.2 DTNB法

1.4.2.1 試劑

0.25 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液;φ=0.03甲醛溶液(用NaOH調(diào)節(jié)pH值8.0);0.01 mol/L DTNB儲(chǔ)存液:由DTNB加0.05 mol/L pH值7的磷酸鹽緩沖液配制，存于棕色瓶中，放于低溫暗處備用;DTNB分析液:由1體積0.01 mol/L DTNB儲(chǔ)存液加100體積的0.5 mol/L、pH值8.0的Tris-HCl緩沖液配制而成，現(xiàn)用現(xiàn)配;200 mg/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液(蒸餾水配置，-80℃保存)。

表1 ALLOXAN試劑法操作步驟

1.4.2.2 操作步驟

按參考文獻(xiàn)[4］，略作改進(jìn)后按表2進(jìn)行。

表2 DTNB法操作步驟

1.4.3 亞硝基鐵氰化鈉法

1.4.3.1 試劑

亞硝基鐵氰化鈉試劑:稱取亞硝基鐵氰化鈉1.5 g，溶于飽和硫酸銨溶液中使成100 mL，此試劑僅能保存1 w;固體硫酸銨;8 mol/L NH4OH;200 mg/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液(蒸餾水配置，-80℃保存)。

1.4.3.2 操作步驟

按參考文獻(xiàn)[3］改進(jìn)后，按表3進(jìn)行。

表3 亞硝基鐵氰化鈉法操作步驟

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 三種測(cè)定方法的比較

采用3種方法測(cè)得的谷胱甘肽在不同濃度時(shí)的反應(yīng)曲線如圖1所示，對(duì)其進(jìn)行回歸分析，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(見表4)。ALLOXAN法和DTNB法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)較高，R2均能夠達(dá)到0.99以上，線性相關(guān)性良好;而亞硝基鐵氰化鈉法相關(guān)系數(shù)較低，僅為0.944，線性相關(guān)性較差。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是因?yàn)閬喯趸F氰化鈉法顯色后很不穩(wěn)定，吸光值很快就下降，在測(cè)定的過程中就可見明顯下降，這給讀數(shù)帶來(lái)很大誤差。

圖1 谷胱甘肽在不同濃度時(shí)的反應(yīng)曲線

表4 三種谷胱甘肽測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

在顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，考察了吸光值隨時(shí)間的變化情況。表5中列出了用3種方法測(cè)定一定濃度的GSH標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)，吸光值隨時(shí)間的變化。結(jié)果表明，在亞硝基鐵氰化鈉法中，GSH在反應(yīng)顯色后生成的色澤很不穩(wěn)定，顯色后吸光值在30 s即見明顯降低，因此要求在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定，而且吸光值在測(cè)定過程中不停變動(dòng)，這給操作的平行性帶來(lái)很大的難度。ALLOXAN試劑法中，反應(yīng)顯色后30 min以內(nèi)吸光值未見降低，顯色穩(wěn)定。DTNB法反應(yīng)顯色后能保持穩(wěn)定20 min。

盡管，ALLOXAN法和DTNB法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定都有很好靈敏度、線性相關(guān)性和顯色穩(wěn)定性，但是由于ALLOXAN法測(cè)定波長(zhǎng)在305 nm，酵母提取液中的很多物質(zhì)(如核酸吸收波長(zhǎng)260 nm，蛋白質(zhì)吸收波長(zhǎng)280 nm)吸收波長(zhǎng)與305 nm非常接近，對(duì)測(cè)定會(huì)有很大干擾。此外，半胱氨酸與ALLOXAN試劑反應(yīng)生成的產(chǎn)物在275 nm也有吸收，而且四氧嘧啶本身在305 nm也有少量吸收。因此，在測(cè)定酵母提取液中GSH時(shí)，ALLOXAN顯示出很多不足，而且要減去四氧嘧啶本身的背景吸收，操作起來(lái)比較繁瑣。DTNB法測(cè)定波長(zhǎng)在412 nm，可以避免核酸、蛋白質(zhì)吸收對(duì)測(cè)定的干擾，而且DTNB本身在412 nm處也沒有吸收、操作簡(jiǎn)便、不需要貴重設(shè)備，在測(cè)定酵母提取液中谷胱甘肽含量上顯示出很大的優(yōu)勢(shì)。綜合考慮上述因素，選擇DTNB法作為實(shí)驗(yàn)的測(cè)定方法，并對(duì)DTNB法作了詳細(xì)的研究，確定了DTNB法的具體操作條件。

表5 三種谷胱甘肽測(cè)定方法顯色穩(wěn)定性

2.2 DTNB法測(cè)定酵母提取液中谷胱甘肽含量

2.2.1 顯色劑DTNB的用量對(duì)體系吸光度的影響

將DTNB儲(chǔ)存液配制成濃度分別為(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0)×10-4mol/L DTNB分析液，測(cè)定不同濃度DTNB分析液作為顯色劑時(shí)體系的吸光度，其余條件均相同。顯色劑用量與體系吸光度之間的關(guān)系見圖2。

圖2 不同DTNB濃度的吸光值

由圖2可知，隨著顯色劑DTNB濃度的增加，體系在412 nm處的吸光度也隨之增加，當(dāng)用量達(dá)到0.8×10-4mol/L以后，體系的吸光度基本保持不變。濃度過低，谷胱甘肽不能完全顯色;濃度過高，會(huì)造成藥品的浪費(fèi)。故實(shí)驗(yàn)中選擇DTNB分析液的濃度為1.0×10-4mol/L。

2.2.2 顯色體系穩(wěn)定性

取0.5 mL 200 mg/L GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，按DTNB法操作，與甲醛反應(yīng)2 min后加入2.5 mL分析液，迅速混勻測(cè)定不同時(shí)間的吸光值，結(jié)果見圖3。由圖3可知，顯色反應(yīng)1.5 min達(dá)到最大值，顯色體系在1.5～20 min內(nèi)吸光度基本穩(wěn)定，超過20 min后，吸光度開始逐漸下降，考慮到由于冬夏室溫變化，加入試劑水浴后吸光值達(dá)最大所需要的時(shí)間可能會(huì)有差異，故實(shí)驗(yàn)中選擇5 min為顯色時(shí)間，在20 min內(nèi)完成試樣的測(cè)定。

圖3 不同顯色時(shí)間下DTNB法吸光值

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品和提取液掃描圖譜

分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和提取液進(jìn)行200～500 nm波段掃描，由掃描圖(圖4)可知，標(biāo)準(zhǔn)品和提取液最大吸收峰均在412 nm，提取液中還存在260～280 nm的核酸與蛋白的吸收峰，但與412 nm相差較遠(yuǎn)，不會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品和提取液紫外-可見分光光度計(jì)掃描圖

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照表2測(cè)定不同濃度谷胱甘肽顯色后的吸光值，如圖1(B)，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行回歸分析得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=272.99x+1.5859，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997，說明GSH濃度在0～200 mg/L與412 nm吸光值呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 半胱氨酸對(duì)谷胱甘肽測(cè)定的干擾試驗(yàn)

半胱氨酸為谷胱甘肽合成的前體，而且酵母提取液中還存在一些其他的含巰基的物質(zhì)，這些物質(zhì)的巰基也能和DTNB反應(yīng)。本方法根據(jù)甲醛與半胱氨酸和GSH反應(yīng)速率的不同，采用合適的甲醛濃度來(lái)消除半胱氨酸等含巰基的化合物對(duì)GSH測(cè)定的干擾。

2.2.5.1 甲醛同Cys和GSH反應(yīng)速率

半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(約1 g/L)和GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 mg/L)，按照DTNB法分別與φ=0.03甲醛反應(yīng)不同時(shí)間后測(cè)定吸光度，以水代替甲醛作為對(duì)照。

表6 甲醛同Cys和GSH的反應(yīng)速率

由表6可知，甲醛與半胱氨酸反應(yīng)較快，而與谷胱甘肽反應(yīng)較慢。3%的甲醛在2 min之內(nèi)，幾乎將半胱氨酸完全掩蔽，而谷胱甘肽受影響很小。本文選用φ=0.03的甲醛反應(yīng)2 min作為反應(yīng)條件。在此條件下，濃度高達(dá)1 g/L的半胱氨酸98%被掩蔽，而僅有1%的GSH被掩蔽，半胱氨酸的存在不會(huì)影響GSH的測(cè)定。

2.2.5.2 Cys共存時(shí)GSH含量分析

各取適量的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液和半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按DTNB法測(cè)定表7中的樣品，同時(shí)以等體積水代替其中的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白對(duì)照。(A樣品-0.010)/A對(duì)照值與1.00無(wú)顯著差異，說明在半胱氨酸共存時(shí)本分析方法可行。

表7 Cys共存時(shí)GSH含量分析

2.2.6 測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精確度

為了考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，同一酵母提取液樣品重復(fù)測(cè)定8次，計(jì)算相對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，由表8可知相對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都很小，方法的準(zhǔn)確度和精確度都是令人滿意的。

表8 DTNB法相對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2.7 回收率試驗(yàn)

在試樣中，加入一定量的待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然后與原試樣同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得結(jié)果之差應(yīng)等于加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量。通過回收率的測(cè)定，可以檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度和試樣所引起的干擾誤差。對(duì)不同酵母提取液樣品進(jìn)行了回收實(shí)驗(yàn)，回收率按下式計(jì)算[5］:

式中，w0為試樣中原有GSH的含量;w為試樣中加入標(biāo)準(zhǔn)GSH的含量;w1為試樣中加入標(biāo)準(zhǔn)GSH后測(cè)得的被測(cè)物的含量。

采用不同酵母提取液進(jìn)行了回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表9。由表9可知，不同酵母提取液，谷胱甘肽回收率在97.254%～101.14%?；厥章试谥眯哦?5%下經(jīng)t檢驗(yàn)，與理論回收率無(wú)顯著差異。回收率平均值99.580，t=0.546﹥0.05，與理論回收率100%無(wú)顯著差異，標(biāo)準(zhǔn)偏差=1.588151。

表9 DTNB法回收率

3 結(jié)論

對(duì)3種測(cè)定谷胱甘肽的方法進(jìn)行了改進(jìn)和比較，綜合各方面的原因考慮，認(rèn)為DTNB法對(duì)于測(cè)定酵母提取液中谷胱甘肽含量具有明顯的優(yōu)勢(shì)。對(duì)DTNB法測(cè)定方法的條件進(jìn)行了研究，其線性度良好，準(zhǔn)確度、精確度都很高，平均回收率達(dá)到99.58%，與理論回收率無(wú)顯著差異。且添加甲醛后，DTNB法能消除半胱氨酸等雜質(zhì)的干擾，是一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的用于酵母提取液中還原型谷胱甘肽測(cè)定的方法。

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ABSTRACTThree kinds of determination methods of glutathione were introduced and evaluated.The results showed that the DTNB method had remarkable advantages in determining glutathione of yeast extraction.The influencing factors of determination were studied and the optimum determination conditions were acquired.This method showed good veracity and precision，and had no statistically significant difference compared with theoretical recovery rate.DTNB method can avoid the disturbance of cysteine and is a simple，fast and economic method.

Key wordsglutathione，determination，yeast extraction

Comparative Study on Quantitative Determination Method of Glutathione in Yeast Extraction

Li Cong-jun1，Xie Ai-di2
1(Department of Bioengineering，Hubei Vocational College of Bio-Technology，Wuhan 430070，China)
2(Department of Biochemistry，College of Engineering and Technology，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China)

碩士研究生。

2010-02-06，改回日期:2010-04-08