多糖化學(xué)改性方法及其生物活性研究進(jìn)展*

張華，王振宇，2，王雪，姚磊，吳志光，楊鑫

1(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈 爾濱，150090)

2(東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱，150040)

3(德之馨(上海)有限公司，上海，201206)

4(國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱，150050)

多糖化學(xué)改性方法及其生物活性研究進(jìn)展*

張華1，王振宇1，2，王雪3，姚磊4，吳志光1，楊鑫1

1(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈 爾濱，150090)

2(東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱，150040)

3(德之馨(上海)有限公司，上海，201206)

4(國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱，150050)

多糖的化學(xué)修飾是一種重要的多糖結(jié)構(gòu)修飾方法，是增強(qiáng)多糖生物活性、降低其副作用的有效途徑。文中綜述了幾種目前多糖化學(xué)改性常用的無機(jī)酸酯化方法，以及目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于化學(xué)改性多糖制備及其生物活性的研究現(xiàn)狀。

多糖，化學(xué)改性，生物活性，研究進(jìn)展

多糖是存在于眾多有機(jī)體中一類具有豐富結(jié)構(gòu)多樣性的特殊生物高分子，多糖作為某些生物轉(zhuǎn)化識(shí)別過程中的關(guān)鍵物質(zhì)已被人們深入地認(rèn)識(shí)，天然多糖已具有許多優(yōu)異性能，如抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗氧化、抗誘變等，多糖這些生物活性的發(fā)揮與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，利用糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團(tuán)，對(duì)多糖進(jìn)行分子表面修飾，可以進(jìn)一步改善多糖的諸多性能，甚至獲得具有特定結(jié)構(gòu)的功能新材料[1］。多糖衍生物的強(qiáng)抗病毒活性已經(jīng)在臨床應(yīng)用上得到了充分的證明，因而對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)修飾是多糖領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。

多糖醚化和酯化反應(yīng)是最具多樣性的多糖改性方法，因?yàn)橥ㄟ^這兩種方法可以很容易獲得各種性能優(yōu)異具有生物來源的新材料[1］。本文主要介紹多糖無機(jī)酸酯化方法及其生物活性，將新穎的酯化方法、全面的結(jié)構(gòu)解析和明確的的構(gòu)效關(guān)系相結(jié)合必將推動(dòng)多糖在生物工程、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 多糖結(jié)構(gòu)表征方法及部分多糖結(jié)構(gòu)

多糖含有易于發(fā)生酯化反應(yīng)的伯羥基、仲羥基和羧基，以及可以轉(zhuǎn)化為氨基化合物的-NH2。要了解衍生化過程中多糖骨架可能發(fā)生的所有結(jié)構(gòu)變化，需在改性前盡可能全面地對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。因?yàn)榧词苟嗵穷愋拖嗤?，多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)包括分支、糖原連接順序、鏈中的氧化部分(如葡聚糖中的醛基、酮基和羧基)和殘余的天然雜質(zhì)均可能存在差異，尤其是在真菌和植物多糖中。

1.1 多糖結(jié)構(gòu)表征方法

要完全闡明一個(gè)糖的結(jié)構(gòu)一般需要提供以下幾方面的信息:⑴分子量及組成單糖的種類與摩爾比;⑵各糖環(huán)的構(gòu)象(呋喃型或吡喃型)與異頭碳的構(gòu)型;⑶各糖殘基間的連接方式;⑷糖殘基的連接順序;⑸二級(jí)結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象等;以及常用到的方法(見表1)。

表1 多糖結(jié)構(gòu)表征中常用的方法

1.2 部分多糖的結(jié)構(gòu)

對(duì)多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的研究，是開發(fā)和利用多糖類物質(zhì)的關(guān)鍵，也是對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)改性的基礎(chǔ)。研究人員已闡明部分真菌多糖的結(jié)構(gòu)[2-8］。

表2 部分多糖的結(jié)構(gòu)

2 多糖硫酸酯化

硫酸酯化多糖(sulfated polysaccharides，SPS)也稱多糖硫酸酯(polysaccharides sulfate，PSS)，是指糖羥基上帶有硫酸根的多糖，是抗病毒多糖中研究最多的一類天然或化學(xué)修飾多糖，包括從動(dòng)、植物中提取的各種硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸衍生物及人工合成、半合成的各種硫酸多糖，具有免疫增強(qiáng)、抗凝血、抗氧化等活性，尤其具有突出的抗病毒(艾滋病毒、巨噬細(xì)胞病毒、流感病毒等)活性。具有高生物活性的硫酸酯多糖一般具有[9］:(1)均一多糖硫酸酯化產(chǎn)物抑制病毒的作用優(yōu)于雜多糖的硫酸酯化產(chǎn)物;(2)每個(gè)單糖單位需要2～3個(gè)才能有好的抗HIV活性，但每個(gè)單糖單位含有有1.5～2個(gè)有良好的抗病毒活性;(3)多糖分子質(zhì)量越小，生物活性越高，在分子質(zhì)量10000～500000之間保持最大活性。

2.1 硫酸酯化多糖合成方法

多糖硫酸酯化常用的方法有Wolfrom法、Ngasawa法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法及三氧化硫-二甲基甲酰胺法等。中性多糖一般能溶于有機(jī)溶劑，可直接對(duì)其硫酸酯化。一般毗喃型多糖的硫酸酯化常采用Wolfrom法，呋喃型多糖常采用Ngasawa法。硫酸化方法的原理為:溶于一定溶劑系統(tǒng)中的多糖與相應(yīng)的硫酸化試劑在一定的條件下反應(yīng)，使得多糖殘基上的某些羥基接上硫酸基團(tuán)。以氯磺酸試劑為例，多糖的硫酸酯化反應(yīng)是在路易斯堿溶液中由SO3H+取代多糖羥基中的H+，經(jīng)中和得到硫酸酯鹽。

2.2 硫酸酯化多糖生物活性

硫酸多糖的活性不僅與硫酸根的存在與否關(guān)系密切，還受硫酸取代度大小的影響。硫酸基的取代位置也是影響硫酸多糖活性的重要因素。盡管硫酸根與硫酸多糖的抗病毒活性密切相關(guān)，但并不是硫酸根越多活性越強(qiáng)，分子中硫酸根過多會(huì)產(chǎn)生抗凝血等副作用。一些海洋硫酸多糖因硫酸基過多而顯示一定的毒性，經(jīng)過脫去部分硫酸基(稱多糖的脫硫修飾)，可降低其毒性。

2.2.1 天然產(chǎn)物中提取

Anthony Josephine等研究從羊棲菜中分離的硫酸酯化多糖能阻止因環(huán)孢霉素而引發(fā)的大鼠腎臟線粒體功能缺失，起到對(duì)環(huán)孢霉素引起大鼠腎臟線粒體抗突變的生物學(xué)效應(yīng)[10］。Mahanama De Zoysa等通過測(cè)定主動(dòng)脈血栓形成時(shí)間研究從發(fā)酵的褐藻中分離得到的硫酸酯化多糖的抗凝血活性，這種硫酸酯化褐藻多糖得率是1.32%，是一種酸性多糖，雖然抗凝活性弱于肝素，但是對(duì)今后海洋藻類資源的開發(fā)具有指導(dǎo)意義[11］。Mao等研究從綠藻袋礁膜中分離多糖的結(jié)構(gòu)和抗輻射作用，具有與其它富含鼠李糖的綠藻多糖不同的化學(xué)組成，硫酸酯化含量約為21.8%，能激活因輻射受損的老鼠的白細(xì)胞和造血功能[12］。

2.2.2 人工合成

硫酸化葡聚糖抗凝血活性的提高和硫酸基團(tuán)的取代度(DS)和分子量有關(guān)，而且取決于2，3，4位的葡萄糖單體上是否有硫酸基取代。Cui等研究野生葛根中(1→6)-α-D-葡萄糖的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，并采用MTT法評(píng)價(jià)硫酸酯化衍生物能夠減輕過氧化氫對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的損傷作用[13］。Guo-Guang Liu合成硫酸酯化紫云英屬多糖具有很高的抗HIV活性[14］。Ronghua Huang等研究適用于制備硫酸酯化殼聚糖的一種新方法及其抗凝血性[15］。Li Wang用氯磺酸-吡啶(CSA-Pyr)法制備九種脫脂米麩多糖硫酸化衍生物，經(jīng)MTT體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性，當(dāng)硫酸化程度在0.81～1.29，糖含量在41.41%～78.56%時(shí)，硫酸化衍生物體外的抗腫瘤活性相對(duì)較高[16］。因此硫酸化修飾是目前多糖結(jié)構(gòu)修飾中研究得最多而且效果突出的一種修飾手段。

2.3 多糖的脫硫修飾

硫酸根具有抗凝血作用，因而部分脫硫，可降低多糖的抗凝活性，從某種意義上降低了毒性。脫硫的研究還有助于探討硫酸根對(duì)海洋多糖的構(gòu)效關(guān)系的影響。此外，在海洋多糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定中定位脫硫非常重要。目前脫硫法有酸脫硫法、堿脫硫法和有機(jī)溶劑脫硫法。最初主要用濃H2SO4和無水乙酸進(jìn)行脫硫，但反應(yīng)條件劇烈，易引起糖苷鍵的斷裂，容易引起多糖構(gòu)象的改變。人們對(duì)此法稍進(jìn)行改進(jìn)，用甲醇分解法在比較溫和的條件下進(jìn)行脫硫。有機(jī)溶劑脫硫法不易引起多糖中糖苷鍵的斷裂，也不易引起多糖分子結(jié)構(gòu)改變，對(duì)多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)分析測(cè)定的研究具有重大意義。

3 多糖羧甲基化

多糖與羧酸或羧酸衍生物的酯化反應(yīng)是目前應(yīng)用最廣泛的多糖改性方法之一。羧甲基化增加多糖溶解度和電負(fù)性，向多糖中引入羧甲基可以提高多糖的水溶性，能給多糖增強(qiáng)活性或帶來新的活性，因而羧甲基化也是常用的對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾的方法。

3.1 羧甲基化多糖合成方法

目前多糖常用的羧甲基化方法是將多糖在NaOH中堿化，再加異丙醇、氯乙酸，獲得羧甲基化衍生物。Katrin Petzold等分別采用乙醇/甲苯，乙醇，異丙醇作為反應(yīng)媒介合成羧甲基化木聚糖并表征其結(jié)構(gòu)[17］。殼聚糖作為一種醫(yī)用生物材料有著廣泛的用途，但是由于其難溶性限制其的廣泛應(yīng)用，而羧甲基化殼聚糖是將其轉(zhuǎn)化成水溶性的有效方法，Hua-Cai Ge等研究微波輔助制備羧甲基化殼聚糖的新工藝，微波輻射會(huì)促進(jìn)反應(yīng)體系質(zhì)的傳遞，會(huì)增加氯乙酸和殼聚糖活性基團(tuán)的反應(yīng)，從而提高羧甲基取代度[18］。

3.2 羧甲基化多糖生物活性

近兩年，關(guān)于多糖的羧甲基化報(bào)道較多，Wang YF等對(duì)從茯苓菌中獲得的水不溶性的β-葡聚糖分別進(jìn)行硫酸化、羧甲基化、甲基化、羥乙基化和羥丙醇化，得到5種水溶性的衍生物，研究發(fā)現(xiàn)硫酸化和羧甲基化衍生物均有顯著的抗S-180腫瘤細(xì)胞和胃癌瘤細(xì)胞活性，而原多糖并沒有此活性[19］。Chen等制備羧甲基化殼聚糖，可以促進(jìn)正常皮膚纖維原細(xì)胞及瘢痕瘤皮膚纖維原細(xì)胞中膠原的分泌[20］。El-Sherbiny研究新的羧甲基化殼聚糖的合成、表征及其吸附金屬離子的能力，可以應(yīng)用在廢水處理領(lǐng)域[21］。

4 多糖乙酰基化

多糖中乙?；鶎?duì)多糖活性有影響，多糖部分乙?；蠖哂锌鼓[瘤活性，因?yàn)橐阴；芨淖兌嗵欠肿拥亩ㄏ蛐院蜋M次序，從而改變多糖的物理性質(zhì)，乙酰基的引入使分子的伸展變化，最終導(dǎo)致多糖羧基基團(tuán)的暴露，增加在水中的溶解性。乙酰基的數(shù)量和位置對(duì)多糖活性有顯著影響。纖維素經(jīng)過乙酰化，乙?；〈鹊陀?.5，以這種低乙酰基取代度的纖維素衍生物為原料進(jìn)行硫酸化修飾，然后脫乙?；?，可得到高硫酸取代度且取代基分布均勻、抗HIV活性更高的硫酸化纖維素。

多糖乙?；闹饕噭┦且宜岷鸵宜狒Ｒ话闶菍⒍嗵侵糜谝欢ǖ娜軇┤邕拎?、甲醇、DMAc/LiCl中，然后加入乙?；噭﹣硗瓿甚；磻?yīng)，乙?；课豢梢园l(fā)生在羥基氧和胺基氮上[22］。Jing Wang等合成了過硫酸化，乙?；捅郊谆N褐藻多糖衍生物，并且研究其體外抗氧化活性。在乙酰化和苯甲?；磻?yīng)中，使用了新型催化劑(NBS)，同時(shí)用紅外光譜和核磁共振光譜研究了其乙?；潭?。乙?；捅郊柞；衷宥嗵茄苌锞哂泻軓?qiáng)的抗氧化活性，并且明顯高于褐藻多糖。苯甲基化褐藻多糖清除超氧和羥基自由基活性最強(qiáng)，而乙酰化的褐藻多糖硫酸酯清除DPPH自由基和還原能力最強(qiáng)。硫酸基、乙?；捅郊柞Ｈ〈鶎?duì)于褐藻多糖體外抗氧化活性起著重要作用，而且抗氧化活性機(jī)制不同[23］。

5 多糖磷酸酯化

在多糖生物合成過程中，向糖原引入磷酸酯基是一個(gè)非常重要的活化步驟，形成糖苷鍵時(shí)磷酸酯基斷裂，糖的磷酸酯類也是一類比較重要的糖類衍生物，多糖磷酸酯化后一般是為了降低多糖的溶解性或增強(qiáng)生物活性，磷酸酯化改性可增加紡織材料的阻燃性，纖維素磷酸酯可用作弱陰離子交換劑。

5.1 磷酸酯化多糖合成方法

磷酸酯化試劑有磷酰氯、磷酸酐、磷酸或其鹽。磷酸及磷酸酐或兩者的混合物是最早采用的磷?；噭话闾擒真I在酸性條件下極易水解，而此反應(yīng)又是在高溫下進(jìn)行，此條件下糖易降解，從而使產(chǎn)物收率和DS均不高，大大限制了該法的應(yīng)用。但一些對(duì)酸穩(wěn)定的多糖或寡糖，用此法進(jìn)行磷?；捅容^簡(jiǎn)單易行。磷酸鹽廉價(jià)、易得，但反應(yīng)活性低，不易獲得高DS的產(chǎn)物。與磷酸相比其優(yōu)點(diǎn)是一般不會(huì)引起多糖的降解。常用的磷酸鹽有磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、偏磷酸鈉或它們的混合鹽。磷酰氯作為磷?；噭┛色@得高DS的磷?；a(chǎn)物，但反應(yīng)激烈、收率低、副產(chǎn)物多、有多種取代磷酸酯，因而限制了它的廣泛應(yīng)用，往往只用于合成簡(jiǎn)單的磷酰酯。一般常用的試劑是三氯氧磷(POCl3)，Yuan等用POCl3作為磷酸化試劑，以吡啶為溶劑制備磷酸酯化多糖[22］。

5.2 磷酸酯化多糖生物活性

采用磷酸化修飾得到的多糖磷酸酯衍生物具有抗病毒、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等活性，并且糖鏈的長(zhǎng)短及磷酸根的數(shù)目與抗腫瘤活性有著密切的關(guān)系。Wang采用三氯氧磷法和多聚磷酸法分別合成兩種褐藻多糖磷酸酯化衍生物，采用環(huán)氧氯丙烷和氨水合成褐藻胺基化衍生物，并分別選取超氧自由基、羥自由基和DPPH清除活性評(píng)價(jià)3種褐藻多糖衍生物體外抗氧化活性，結(jié)果顯示磷酸酯化的褐藻多糖衍生物表現(xiàn)出更強(qiáng)的羥自由基和DPPH清除活性，揭示不同取代基團(tuán)與抗氧化能力之間的關(guān)系[25］。目前關(guān)于糖磷酸酯化修飾的研究報(bào)道還比較少，而且對(duì)于多糖、寡糖及其類似物的磷酸酯衍生物的生物活性、磷酸基在其中的作用及作用機(jī)制還不明確，尚待進(jìn)一步深入研究。

6 多糖硝酸酯化

多糖硝酸酯通常由多糖與硝酸和硫酸的混合硝化劑按一定的比例反應(yīng)制備，幾乎完全衍生化的淀粉硝酸酯(DS3)可用作炸藥，其制備過程與纖維素的硝酸酯化過程類似。此外，將淀粉溶解在N2O4/DMF中，在甲醇存在下，繼續(xù)加熱中間體淀粉亞硝酸酯，也可制得淀粉硝酸酯。纖維素硝酸酯是迄今最重要的多糖硝酸酯，簡(jiǎn)稱為“硝化棉”，已應(yīng)用到許多領(lǐng)域(見表3)。采用不同硝化試劑，可以獲得不同DS的產(chǎn)物。采用90%HNO3與磷酸和脫水劑P2O5的混合物，或者90%HNO3與乙酸酐的混合物，均可對(duì)纖維素進(jìn)行完全硝酸酯化改性(DS=3)，中間體乙酰硝酸酯是高反應(yīng)活性的硝化試劑。DS3的纖維素硝酸酯可用于分析領(lǐng)域，用于黏度法或SEC法測(cè)定分子量和分子量分布。在無水條件下，消化反應(yīng)不影響多糖的平均聚合度(DP)[1］。

表3 具有不同DS值的纖維素硝酸酯的溶解性及應(yīng)用領(lǐng)域[1］

7 小結(jié)

自然界中存在的多糖并不都具有活性。有些多糖由于結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)等障礙而不利于其生物學(xué)活性的發(fā)揮。有些從天然生物體內(nèi)分離的多糖活性較弱，有待進(jìn)一步提高。有些多糖不溶于水，影響進(jìn)一步的藥理研究。多糖的活性與多糖的結(jié)構(gòu)、分子量、溶解性等諸多因素緊密相關(guān)。因此，采取一定的化學(xué)方法對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)修飾是解決以上問題的根本途徑。筆者在實(shí)驗(yàn)室制備了一些硫酸化、乙酰化、羧甲基化的黑木耳多糖，目前正在研究其抗癌活性。但是多糖的衍生化也有使原有活性減弱或喪失，因此多糖的衍生化關(guān)鍵在于確定多糖的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系，確保多糖在衍生化后活性中心的立體構(gòu)象處于最佳狀態(tài)。

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ABSTRACTChemical modification is an important method of structural modification for polysaccharides.It is an effective way to enhance the biological activities of polysaccharide and reduce their side effects.In this paper，several inorganic ester methods commonly used for polysaccharide and their activities of modified polysaccharides were summarized at present.

Key wordspolysaccharide，chemical modification，biological activity，research advancements

Research Advancements of Chemical Modification of Polysaccharide and Their Biological Activities

Zhang Hua1，Wang Zhen-yu1，2，Wang Xue3，Yao Lei4，Wu Zhi-guang1，Yang Xin1
1(Shool of Food Science and Engneering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China)
2(Northeast Forestry University，Harbin 150040，China))
3(Symrise(Shanghai)Co.，Ltd.，Shanghai 201206，China)
4(National Research Soybean Engineering and Technology Center，Harbin 150050，China)

博士研究生，講師(王振宇博士生導(dǎo)師為通訊作者)。

*國(guó)家863項(xiàng)目(2007AA100404)

2010-01-28，改回日期:2010-04-13