乳鐵蛋白肽的抑菌活性及其基因工程制備*

巴特，丁卓平，劉承初

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)

乳鐵蛋白肽的抑菌活性及其基因工程制備*

巴特，丁卓平，劉承初

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)

乳鐵蛋白肽是乳鐵蛋白在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶裂解，從N端釋放的具有兩親性的陽(yáng)離子多肽，具有廣譜抗菌活性。目前，乳鐵蛋白肽主要是通過(guò)水解乳鐵蛋白來(lái)獲得，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)，基因工程技術(shù)將是大規(guī)模生產(chǎn)乳鐵蛋白的最佳途徑。文中對(duì)乳鐵蛋白肽的抑菌活性及其轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)技術(shù)(包括表達(dá)系統(tǒng)的選擇與比較，基因工程菌發(fā)酵液中乳鐵蛋白肽的分離和純化等)進(jìn)行了簡(jiǎn)要的綜述。

乳鐵蛋白肽，抗菌肽，基因工程

乳鐵蛋白(lactoferrin)是一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白一樣屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白科，由哺乳動(dòng)物黏膜上皮細(xì)胞分泌，分子質(zhì)量約為80 ku[1-2］。乳鐵蛋白約含690個(gè)氨基酸，不同種類(lèi)的乳鐵蛋白氨基酸序列具有非常高的同源性，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和β-折疊組成，其中人和牛乳鐵蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋多于β-折疊[2］，并在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上折疊成兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的具有相似結(jié)構(gòu)的球狀葉(N-葉和C-葉)，兩葉氨基酸序列具有40%的同源性，同時(shí)各具有一個(gè)鐵離子結(jié)合位點(diǎn)[3-4］。乳鐵蛋白的諸多生理功能均與其可逆鰲合Fe3+和能通過(guò)特殊的受體連接到細(xì)胞表面的特性有關(guān)[4-5］，其生理功能主要有廣譜抗菌、抗過(guò)敏、參與免疫調(diào)節(jié)和抗炎癥作用、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗血小板凝集、抑制半胱氨酸蛋白酶等[6-9］。乳鐵蛋白主要分布于多種哺乳動(dòng)物(除大鼠、兔和狗外)的白細(xì)胞和多種組織外分泌液中，如乳汁、淚液、膽汁、黏膜液、唾液等，其中乳汁中含量最為豐富，其含量?jī)H次于酪蛋白，其中人乳中含量約為1.0～3.2 mg/mL，豬、豚鼠、小鼠和馬乳中含量約為0.2～2.0 mg/mL，牛乳、山羊乳中約0.02～0.2 mg/mL。此外，乳汁中的含量與泌乳時(shí)間存在一定的負(fù)相關(guān)性，初乳中含量高達(dá)7 mg/mL，隨著泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)其含量逐漸降低[4，10-14］。

乳鐵蛋白肽(lactoferricin，Lfcin)是乳鐵蛋白在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶裂解，從N端釋放的具有兩親性的陽(yáng)離子抗菌肽[15-17］，Lfcin含有25個(gè)氨基酸，多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接成環(huán)狀，它不易被蛋白酶進(jìn)一步酶解，除不能參與鐵代謝外，具備完整乳鐵蛋白的所有生物學(xué)活性，如抗菌、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、參與免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控基因表達(dá)等[18-19］，雖然其抗病毒能力弱于完整乳鐵蛋白[13］，但其抗菌性遠(yuǎn)強(qiáng)于完整的乳鐵蛋白。

1 乳鐵蛋白肽抗菌功能

Abe等[20］在研究脫鐵型乳鐵蛋白在酸性條件下的熱穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)在pH值2.0～3.0條件下100℃加熱5 min，LF明顯發(fā)生了降解，然而其抗菌活性卻有所增加，于是推測(cè)LF中存在耐熱的抗菌活性多肽。Tomita等[21］研究了牛乳鐵蛋白的蛋白酶水解物的抗菌效果，結(jié)果表明:豬胃蛋白酶、鱈魚(yú)蛋白酶、酸性蛋白酶水解得到的小分子多肽具有較強(qiáng)的抗菌作用，其抗菌活性是未降解前的8倍以上。此后，Bellamy等[15］分別在人、牛乳鐵蛋白N端附近分離到一條多肽，其抗菌活性分別是人乳鐵蛋白的2倍、牛乳鐵蛋白的12倍，即乳鐵蛋白肽，其中牛乳鐵蛋白肽抗菌能力是人乳鐵蛋白肽的9倍。Lfcin抗菌能力主要表現(xiàn)為廣譜的抑菌和殺菌作用[15，22］。Bellamy等[23］研究了牛乳鐵蛋白肽(LfcinB)的抗菌譜(表1)，所選擇的菌株包括G+和G-、桿菌和球菌、專(zhuān)性需氧菌、兼性厭氧菌和專(zhuān)性厭氧菌。

由表1可知:LfcinB除對(duì)熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、糞腸道球菌(Entercoccus faecalis)沒(méi)有抑菌作用外，對(duì)其他生長(zhǎng)的檢測(cè)菌株均有不同程度的抑制作用，抑菌效果與培養(yǎng)基和細(xì)菌種類(lèi)有關(guān)，其抑菌濃度范圍在0.6～45 μg/mL，且G+對(duì)LfcinB更為敏感。

除細(xì)菌外，Lfcin，特別是LfcinB也能有效抑制一些酵母、霉菌及絲狀真菌的生長(zhǎng)，如白色假絲酵母菌(Candma albicans JCM 2900)、隱球酵母菌(Cryptococcus uniguttulatus JCM 3685)、煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus JCM 1917)、青霉(Penicillium pinophilum JCM 5593)、須發(fā)癬菌(Trichophyton mentagrophytes IFO 5466)等[24-25］。

食品安全是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的大事，全天然綠色抑菌劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用是中國(guó)乃至世界的前沿課題。乳鐵蛋白是一種天然存在，廣泛分布于人和家畜乳汁、唾液、眼淚等外分泌液的鐵結(jié)合糖蛋白，具有安全無(wú)害的特點(diǎn)。乳鐵蛋白及其水解產(chǎn)物具有高效、廣譜的抗菌活性已得到科學(xué)驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)去鐵飽和度和固定化處理等特殊工藝活化的乳鐵蛋白(ActivinTMAcivated Lactoferrin?，aLF Ventures，LLC)，已作為一種安全高效的抑菌劑被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于牛肉的保鮮與抑菌。乳鐵蛋白肽是由乳鐵蛋白經(jīng)蛋白酶降解產(chǎn)生的，具有比乳鐵蛋白更強(qiáng)的抗菌活性，且不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的新型抗菌肽，然而天然分離Lfcin產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜，成本昂貴，而人工合成Lfcin費(fèi)用更高，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)，從而制約乳鐵蛋白肽的廣泛應(yīng)用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)乳鐵蛋白肽將是解決工業(yè)用Lfcin來(lái)源不足最有效的途徑。

2 采用基因工程技術(shù)制備乳鐵蛋白肽

由于生物體內(nèi)乳鐵蛋白含量比較低，不能滿(mǎn)足大規(guī)模商業(yè)化的需要，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是能夠大規(guī)模生產(chǎn)活性蛋白的有效途徑，目前已有許多學(xué)者克隆了人、牛和豬乳鐵蛋白肽基因，并在細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)，基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組蛋白的流程主要有合成目的基因、構(gòu)建重組質(zhì)粒、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主、重組蛋白的表達(dá)及目的產(chǎn)物的分離純化，而目的基因的合成、重組質(zhì)粒的構(gòu)建及目的蛋白的純化過(guò)程也因表達(dá)系統(tǒng)的不同而有所差異，目前所采用的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、真菌表達(dá)系統(tǒng)、動(dòng)植物表達(dá)系統(tǒng)。

2.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以大規(guī)模表達(dá)目的蛋白、生長(zhǎng)周期短，并且外源DNA容易轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中、DNA需要量少，因此Lfcin基因工程制備方面的研究大多數(shù)集中采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但由于Lfcin對(duì)細(xì)菌的殺傷作用，不能用大腸桿菌直接表達(dá)具有生物活性的Lfcin，而需采用融合蛋白的形式表達(dá)[26］。羅紅霞等[27］對(duì)魯西黃牛乳鐵蛋白肽基因的克隆及其在大腸桿菌中的融合表達(dá)及其抗菌活進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，重組乳鐵蛋白肽對(duì)大腸桿菌(E.coli C84010)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 184)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和變形鏈球菌(Streptococcus mutans)均有抑菌活性。Feng等[28］和Tian等[29］根據(jù)大腸桿菌E.coli偏愛(ài)的密碼子，化學(xué)合成編碼LfcinB的氨基酸片段，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中成功表達(dá)了乳鐵蛋白肽，重組的Lfcin可以抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923)的生長(zhǎng)。Kim等[26］研究了乳鐵蛋白肽與陰離子肽在大腸桿菌中的融合表達(dá)，此項(xiàng)研究采用PCR技術(shù)將乳鐵蛋白肽與改良過(guò)的滑爪蟾素結(jié)合，使原本具有堿性特征的乳鐵蛋白肽中和至酸性，融合基因在大腸桿菌DE3中表達(dá)，每升細(xì)菌培養(yǎng)物中可獲得60 mg純化的乳鐵蛋白肽，并且具有生物活性。鄧強(qiáng)等[30］根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)了牛乳鐵蛋白肽的3段引物序列，通過(guò)PCR合成并經(jīng)雙酶切后克隆入pED質(zhì)粒的BamHI和HindsIII位點(diǎn)之間，構(gòu)建出牛乳鐵蛋白肽的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至E.coli BL-21(DE3)中獲得牛乳鐵蛋白肽基因克隆菌。該克隆茵經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后，可表達(dá)出數(shù)量可觀的融合蛋白，且表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間呈一定相關(guān)性，經(jīng)檢測(cè)重組牛乳鐵蛋白氨基酸序列與天然乳鐵蛋白肽完全一致。

上述研究均采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法來(lái)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。融合表達(dá)是目前運(yùn)用原核系統(tǒng)進(jìn)行的Lfcin基因工程研究的主要方式，雖然Lfcin與其它基因融合后均能得到表達(dá)，也顯示了生物活性，但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不能對(duì)乳鐵蛋白肽進(jìn)行正確的糖基化等加工后修飾工作，適用于生產(chǎn)不需糖基化等翻譯后加工修飾的重組蛋白[31］。

2.2 真菌表達(dá)系統(tǒng)

利用原核生物——大腸桿菌作為宿主菌生產(chǎn)外緣蛋白技術(shù)已相當(dāng)成熟，有不少已經(jīng)發(fā)展到工業(yè)規(guī)模，但大腸桿菌合成的外源蛋白大多已以包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi)，且不能對(duì)真核蛋白進(jìn)行糖基化等翻譯后修飾工作，因此很難直接得到具有生物活性的真核蛋白。真菌表達(dá)系統(tǒng)作為低等真核生物，具有與哺乳類(lèi)細(xì)胞相似的翻譯后加工修飾功能，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，它可以在簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)，是真核基因外源表達(dá)的理想宿主，目前已有多種真核蛋白在真菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)[9，32-33］。酵母和絲狀真菌是目前用于表達(dá)真核蛋白的常用載體。

酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，馮永潛等[34］化學(xué)合成了Lfcin B基因序列，實(shí)現(xiàn)了其在釀酒酵母中的表達(dá)，該研究證實(shí)了目的蛋白的表達(dá)及其抑菌活性，但未對(duì)表達(dá)量作進(jìn)一步的研究，釀酒酵母已被廣泛用作外源蛋白的表達(dá)宿主，為基礎(chǔ)研究和疫苗產(chǎn)業(yè)化作出了巨大貢獻(xiàn)，但是存在外源基因不穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失和蛋白質(zhì)過(guò)度糖基化等局限性。畢赤酵母是一種以甲醇為唯一碳源和能源的低等真核生物，能高水平分泌表達(dá)外源蛋白，并對(duì)其進(jìn)行正確的翻譯后加工修飾，并且不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，同時(shí)具有在特定條件下高密度生長(zhǎng)的特性，是基因工程中良好的真核基因受體菌，已成功表達(dá)了從人內(nèi)抑制素到蛛拉絲蛋白近400種蛋白[35-37］。馬鳳龍等[38］將化學(xué)合成的LfcinB編碼基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中成功表達(dá)了LfcinB，證明利用化學(xué)合成法直接合成的編碼Lfcin B的DNA構(gòu)建真核表達(dá)載體、通過(guò)生物發(fā)酵工程來(lái)制備LfcinB是可行的。

由于酵母是比較低等的真核生物，雖然能表達(dá)、分泌外源蛋白及翻譯后修飾加工，但表達(dá)水平普遍偏低，修飾模式也與高等真核生物存在很大差別，絲狀真菌可以彌補(bǔ)酵母表達(dá)系統(tǒng)的一些不足，絲狀真菌既可以大量分泌各種外源蛋白，使人們得到大量胞外生物活性蛋白，又可以對(duì)真核蛋白進(jìn)行較正確的肽鏈剪切和糖基化等后加工修飾，且蛋白質(zhì)糖基化模式與高等真核生物模式非常相似，與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，成本較低，從而成為一種理想的表達(dá)重組蛋白的宿主[39］，目前可用于表達(dá)重組蛋白的絲狀真菌有黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、醬油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、Chrysosporium lucknowense、Fusarium graminearum、Trichoderma reesei[40］。

2.3 植物表達(dá)系統(tǒng)

植物作為高等真核生物，具有與動(dòng)物細(xì)胞相似的結(jié)構(gòu)和功能，能正確表達(dá)和大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白，特別適用于具有復(fù)雜翻譯后加工修飾過(guò)程的異源蛋白，如糖蛋白。同時(shí)人類(lèi)在植物栽培、繁育等方面已形成較為完備的理論與技術(shù)體系，省去了昂貴的發(fā)酵設(shè)備和廠房投資，同時(shí)也減少了培養(yǎng)基和能源消耗，降低了生產(chǎn)成本，據(jù)報(bào)道植物表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)成本僅為微生物發(fā)酵系統(tǒng)的2%～10%、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的0.1%左右，且植物中不含潛在的人類(lèi)病源體，不易被哺乳動(dòng)物病毒、血傳病原體、致癌基因等所污染，產(chǎn)品安全，因此利用植物生產(chǎn)外源蛋白展現(xiàn)了極其誘人的前景[41-43］。目前可用植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的外源蛋白包括抗體、疫苗、生物酶、血清蛋白、葡萄糖腦苷脂酶、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子、荷爾蒙和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素等[44-45］，采用的植物宿主主要有煙草、馬鈴薯、番茄、玉米、水稻、小麥、大豆、豌豆和香蕉等[46-48］。

2.4 動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)

昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)具有與高等真核生物相似的翻譯后加工修飾能力，利用重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白是目前普遍采用的方法，另一類(lèi)建立在對(duì)果蠅等昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上的新型表達(dá)系統(tǒng)，在穩(wěn)定性和表達(dá)效率方面有著更為突出的優(yōu)點(diǎn)。昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)具有比哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更高的表達(dá)效率以及更好的產(chǎn)品安全性，目前已經(jīng)利用昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)成功地生產(chǎn)了鼠源單克隆抗體、人-鼠嵌合抗體、單鏈抗體及人單克隆抗體等多種抗體分子[31，49-50］。Nakamura等[51］用昆蟲(chóng)細(xì)胞克隆表達(dá)了牛乳鐵蛋白N端部分，雖然編碼LfcinB的基因序列發(fā)生了一處突變，但是并沒(méi)有使LfcinB氨基酸序列發(fā)生變化，重組LfcinB對(duì)E.coli O111具有抗菌性，這也證明采用昆蟲(chóng)細(xì)胞大規(guī)模表達(dá)重組乳鐵蛋白肽是可行的。

由于原核細(xì)胞缺少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等用于糖基化修飾的結(jié)構(gòu)和機(jī)制，所表達(dá)產(chǎn)物為非糖基化蛋白，并常常以包涵體形式存在;酵母、植物及昆蟲(chóng)等真核細(xì)胞雖能對(duì)目的蛋白進(jìn)行糖基化修飾，但其糖基化方式與人類(lèi)等哺乳動(dòng)物細(xì)胞仍存在差別(各種表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)的比較見(jiàn)表2)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)最主要的優(yōu)點(diǎn)是它可以識(shí)別真核蛋白的合成、加工和分泌信號(hào)，研究表明，目的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類(lèi)型和方式幾乎相同，因此利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物高效表達(dá)Lfcin也成為生產(chǎn)具有各種生物活性的的重組Lfcin的有效途徑。張錦霞等[52］通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得LfcinB基因，并在山羊和奶牛乳腺中成功表達(dá)了具有生物活性的LfcinB，開(kāi)辟了一條生產(chǎn)LfcinB的新途徑，這為L(zhǎng)fcinB的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

表2 各類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)的比較

由于表達(dá)系統(tǒng)的不同，融合蛋白的分離純化過(guò)程也有所不同:采用大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的Lfcin的分離純化過(guò)程主要為:菌體收集、細(xì)胞裂解、包涵體的分離和裂解、Lfcin的純化[34，29］。Lfcin的純化可以采用鹽析和有機(jī)溶劑沉淀法粗提，但制備高純度的重組蛋白需采用離子交換、HPLC和親和層析中的一種或幾種方法共同使用。

從植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中分離目的蛋白是一項(xiàng)昂貴、技術(shù)要求較高的工作，需要沉淀、吸附、色譜分離和過(guò)濾等復(fù)雜的分離步驟。乳腺生物反應(yīng)器的的蛋白分離純化過(guò)程簡(jiǎn)單，乳品生產(chǎn)已具有成熟的技術(shù)和設(shè)施，早已實(shí)現(xiàn)機(jī)械化，乳汁內(nèi)源成分相對(duì)簡(jiǎn)單，通過(guò)傳統(tǒng)的制酪技術(shù)去除奶中的酪蛋白之后，目的產(chǎn)品留在乳清中，一般的純化工藝就能獲得純度較高的產(chǎn)品。

本實(shí)驗(yàn)室曾采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(E.coli BL21(DE3))成功表達(dá)了鮭魚(yú)精蛋白等生物活性肽，我們根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)了牛乳鐵蛋白肽的3段引物序列，通過(guò)PCR合成構(gòu)建出牛乳鐵蛋白肽的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至E.coli BL-21(DE3)中，成功構(gòu)建了表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的基因克隆菌，經(jīng)乳糖誘導(dǎo)7 h后融合蛋白表達(dá)量達(dá)48%。由于大腸桿菌表達(dá)分泌的外源蛋白是以包涵體的形式存在，所以LfcinB的分離純化過(guò)程包括包涵體的分離、融合蛋白的分離、融合蛋白的酸水解和柱層析4個(gè)過(guò)程，實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。上述流程可分離得到純度為81%的牛乳鐵蛋白肽，得率為41.5 mg/L發(fā)酵液。

圖1 Lfcin分離純化流程

由于乳鐵蛋白為乳汁等分泌液中天然存在的活性物質(zhì)，人們?cè)谑秤萌榧叭橹破窌r(shí)即能攝入體內(nèi)時(shí)，也會(huì)在胃蛋白酶的作用下水解成Lfcin B，因此乳鐵蛋白及其水解產(chǎn)物可以作為天然物質(zhì)添加到食品中，不必?fù)?dān)憂其本身的食用安全性，加之其具有廣泛而獨(dú)特的功能特性，美國(guó)、澳大利亞、日本等國(guó)早在20世紀(jì)70年代就已投入巨大的人力、物力進(jìn)行了深入研究，為其商業(yè)化開(kāi)辟了十分誘人的前景。目前Lfcin主要通過(guò)水解乳鐵蛋白來(lái)獲取，但分離乳鐵蛋白工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本昂貴，乳鐵蛋白是新西蘭出口的最昂貴的奶制品之一，通常從1.4萬(wàn)t原奶才能提取1 t乳鐵蛋白，因此它的售價(jià)高達(dá)NZ$500，000/t(約34萬(wàn)美元)，由此可知通過(guò)水解乳鐵蛋白來(lái)獲得Lfcin成本將更加昂貴，所以利用基因工程技術(shù)大量表達(dá)Lfcin，以用于臨床治療和預(yù)防某些病原微生物的感染，將是最具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的一個(gè)選擇。目前可以采用細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白，并且每種表達(dá)系統(tǒng)均具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，如生長(zhǎng)周期最短的為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但其加工后修飾功能最弱;成本最低及最易擴(kuò)大化生產(chǎn)的為植物表達(dá)系統(tǒng)，但生長(zhǎng)周期太長(zhǎng)、表達(dá)過(guò)程不易調(diào)節(jié);加工后修飾功能最好、最易調(diào)節(jié)的為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，但其成本過(guò)高、不易大規(guī)模生產(chǎn)[61，64］。因此選取最適宜于商業(yè)化生產(chǎn)的的表達(dá)系統(tǒng)要取決于諸多因素，如實(shí)驗(yàn)條件、生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效率、目的蛋白生物學(xué)活性是否有與天然產(chǎn)品存在差異和產(chǎn)品安全性和穩(wěn)定性等等。

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ABSTRACTLactoferricin is an amphipathic，cationic peptide with stronger anti-microbial activity than lactoferrin.It was mainly generated by the pepsin-mediated digestion from N-terminal of lactoferrin in small scale，Genetic engineering will be the best method to produce lactoferricin.This paper gives an overview on antimicrobial activities of lactoferricin and its production by genetic engineering including the selection and comparision of expression systems，isolation and purification of lactoferricin from the fermented broth of genetic engineering bacteria.

Key wordsLactoferricin，antibacterial peptides，genetic engineering

Overview on Antimicrobial Activities of Lactoferricin and Its Genetic Engineering Production

Bate，Ding Zhuo-ping，Liu Cheng-chu
(College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

碩士研究生(劉承初教授為通訊作者)。

*上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目(09ZZ166)，上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)

2009-12-21，改回日期:2010-04-07