加鹽量對固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物的影響及其動(dòng)力學(xué)研究*

張建友，姜艷喜，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州，310014)

加鹽量對固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物的影響及其動(dòng)力學(xué)研究*

張建友，姜艷喜，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州，310014)

采用控溫、加曲、低鹽殺菌工藝結(jié)合固態(tài)發(fā)酵技術(shù)對魷魚廢棄物進(jìn)行再加工利用，以減少環(huán)境污染并高效利用蛋白資源。綜合考慮固態(tài)發(fā)酵過程中的蛋白酶活力、氨基態(tài)氮含量、總酸含量、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量等指標(biāo)來研究最佳的發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，8 g/100 g(原料)加鹽量下，氨基氮、TCA可溶性氮(TCA-N)、總可溶性氮(TSN)較高，TVB-N含量較低，丙二醛含量(TBARS值)較低，確定8 g/100 g(原料)加鹽量為最適宜的發(fā)酵加鹽量。同時(shí)采用ORIGIN7.5軟件得到了氨基氮生成動(dòng)力學(xué)模型，在一定程度上揭示了發(fā)酵的基本特征，用來預(yù)測發(fā)酵液中氨基氮濃度。

米曲霉，加鹽量，魷魚廢棄物，固態(tài)發(fā)酵

魷魚加工中大約會產(chǎn)生魷魚本身體重50%的廢棄物，這些廢棄物的隨意處置可能會導(dǎo)致資源浪費(fèi)以及環(huán)境污染等問題[1］。近年來，伴隨著我國魷釣業(yè)以及沿海地區(qū)魷魚加工業(yè)的快速發(fā)展，如何利用這些廢棄物已經(jīng)成了當(dāng)務(wù)之急[2］。筆者探討了利用米曲霉發(fā)酵魷魚廢棄物產(chǎn)風(fēng)味前體物質(zhì)的工藝技術(shù)路線，為今后魷魚廢棄物再利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

米曲霉3042、豆粕、麩皮，杭州市食品釀造有限公司。

魷魚廢棄物，中國水產(chǎn)舟山海洋漁業(yè)有限公司，實(shí)驗(yàn)室貯藏于-20℃冰柜中。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CR21GⅡ高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司;752N紫外可見分光光度計(jì)、PHS-3CpH計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司;450Watt食品調(diào)理機(jī)4162，德國博朗有限公司;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司;98-Ⅱ型強(qiáng)磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺;BSP-250生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 米曲霉3042的活化培養(yǎng)

以無菌操作方式，將4℃冰箱保藏菌種米曲霉3042轉(zhuǎn)接于試管豆汁斜面培養(yǎng)基上，30℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96 h(根據(jù)生長情況以及菌種的保藏時(shí)間可以選擇進(jìn)行2代或者3代活化培養(yǎng))。

1.3.2 米曲霉3042的擴(kuò)大培養(yǎng)

以無菌操作方式，將活化好的菌種轉(zhuǎn)接于茄子瓶豆汁斜面培養(yǎng)基上，30℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96 h。

1.3.3 制種曲

采用100 mL三角瓶培養(yǎng)m(豆粕)∶m(鼓皮)=1∶3，水分含量52%，121℃滅菌30 min)，將擴(kuò)大培養(yǎng)的米曲霉制成孢子懸浮液，按一定量(1 mL菌懸液/10 g固體培養(yǎng)基)接入種曲三角瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h，其間手動(dòng)搖瓶2次。

1.3.4 米曲霉3042固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物

米曲霉3042固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物的工藝流程見圖1。主要控制點(diǎn):分裝100 mL漿液于500 mL三角瓶中;105℃濕熱滅菌40 min;30℃搖床靜置發(fā)酵(每隔12 h搖瓶翻曲)。

圖1 米曲霉固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物工藝流程

1.4 分析方法

蛋白酶酶活力的測定:福林酚法[3］;氨基態(tài)氮:甲醛滴定法(GB 5009.39-851996);揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N):半微量擴(kuò)散法[4］;總酸含量的測定:電位滴定法(GB/T 12456-901991);總可溶性氮(TSN)含量測定:凱氏定氮法[5］;TCA可溶性氮(TCA-N)含量測定;游離脂肪酸含量以及酸價(jià)的測定:KOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定法[7］;pH值測定:酸度計(jì);脂肪氧化丙二醛含量(TBARS值)的測定:見文獻(xiàn)[8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 加鹽量對米曲霉固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物理化指標(biāo)的影響

2.1.1 對發(fā)酵過程中蛋白酶活力的影響

米曲霉固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物的過程中主要產(chǎn)生氨基酸和短肽，其中有一部分是呈味氨基酸，使得發(fā)酵液具有獨(dú)特的風(fēng)味。而這些氨基酸和短肽的產(chǎn)生則主要由于種曲和發(fā)酵過程中米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶水解魷魚廢棄物蛋白質(zhì)所得，但是食鹽卻對蛋白酶酶活力的大小具有顯著的影響作用[9］。食鹽對酶活力的影響通常因酶種類及食鹽濃度不同而有差異，一般情況下，高鹽會明顯抑制蛋白酶活力。

在食品工業(yè)生產(chǎn)中，中性蛋白酶很重要，因?yàn)橹行缘鞍酌改軐⒌鞍踪|(zhì)水解成氨基酸、多肽等，并可減少蛋白水解苦味物質(zhì)產(chǎn)生[10］。鑒于發(fā)酵初始環(huán)境pH值是弱酸性，并且整個(gè)發(fā)酵過程中的pH值基本都在弱酸性的條件下，所以同時(shí)研究了發(fā)酵過程中酸性蛋白酶的活力變化。

圖2、圖3、圖4揭示了發(fā)酵過程中蛋白酶酶活力的變化趨勢，可以看出:(1)在不同的加鹽量下初始的酶活力不相同，隨著鹽濃度的升高，蛋白酶酶活力明顯降低，這與Sappasith Klomklao等[11］的研究現(xiàn)象相同，加鹽量16g/100g(原料)的各種酶的酶活力明顯受到了抑制，這可能是因?yàn)楦啕}作用下，NaCl的高滲透壓作用使蛋白酶分子的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，降低蛋白酶的生理活性，使酶活下降;另外，也可能是因?yàn)榈鞍酌赴l(fā)生鹽析變性，降低了酶活[12-13］。(2)在不同的加鹽量下，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，各種酶的酶活力都是逐漸升高的，發(fā)酵到第6天后各種酶的酶活力增加變緩逐漸趨于平穩(wěn)，有的甚至開始下降，這可能是蛋白酶的自溶分解以及代謝產(chǎn)物氨基酸、多肽等的抑制作用[14］所致。

2.1.2 對發(fā)酵過程中氨基氮、TCA-N、TSN的影響

發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基酸和短肽主要是微生物源蛋白酶水解作用的效果，這是由于發(fā)酵之前的滅菌過程已經(jīng)使內(nèi)源性蛋白酶失活。因此發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基氮含量的高低是評價(jià)發(fā)酵質(zhì)量的重要指標(biāo)，可以用于表征蛋白質(zhì)的水解程度[15-17］。TCA-N含量變化是衡量生物活性肽含量的重要指標(biāo)，這對研究魷魚內(nèi)臟中生物活性物質(zhì)具有重要的意義;TSN同樣是衡量發(fā)酵過程氮含量變化的重要指標(biāo)，結(jié)合氨基氮含量用來表征蛋白質(zhì)的變化。因此考察了發(fā)酵過程中氨基氮、TCA-N、TSN的變化情況。

圖2 加鹽量對發(fā)酵過程中酸性蛋白酶的影響

圖3 加鹽量對發(fā)酵過程中中性蛋白酶的影響

圖4 加鹽量對發(fā)酵過程中堿性蛋白酶的影響

圖5 加鹽量對發(fā)酵過程中氨基氮含量的影響

圖6 加鹽量對發(fā)酵過程中TCA-N含量的影響

圖7 加鹽量對發(fā)酵過程中TSN含量的影響

從圖5-圖7可見，不同加鹽量下氨基氮，TCAN，TSN隨時(shí)間的變化趨勢與蛋白酶酶活力的變化規(guī)律基本一致，都在第6天后開始變化緩慢。4、8、12、16 g/100 g(原料)的加鹽量下發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量第10天分別達(dá)到0.725、0.671、0.626 g/100 mL 和0.502 g/100 mL。其氨基態(tài)氮含量隨加鹽量的遞增呈遞減趨勢，可能是因?yàn)楦啕}使蛋白質(zhì)脫水并中和其電荷，而從溶液中沉淀出來，使蛋白質(zhì)凝聚變性，降低了酶活，從而降低水解率，導(dǎo)致水解度降低，氨基酸含量減少[18］;另一方面，最終產(chǎn)物如氨基酸、多肽的存在也抑制了一部分酶活，從而降低了水解度[14］;同時(shí)高鹽對于發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)也有類似作用，使蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析變性，沉淀出來，使蛋白質(zhì)含量下降，導(dǎo)致水解得到的氨基態(tài)氮也減少。

不同加鹽量下TCA-N和TSN的初始含量不同，這是由于在不同的鹽濃度下它們的溶解度不同導(dǎo)致初始含量不同。但它們的總體變化趨勢與氨基氮的變化趨勢相同，這可能是由于原料蛋白質(zhì)不斷被蛋白酶水解變成可溶性的肽類及氨基酸成分，其實(shí)主要源于較高的蛋白酶活力以及均質(zhì)加工增加了酶作用面積[19］。TSN包括氨基氮和一些可溶性的蛋白氮，由圖6，圖7我們發(fā)現(xiàn)12g/100g(原料)的加鹽量下，在發(fā)酵的第4天其TSN和TCA-N含量超越了其他3種加鹽量的發(fā)酵工藝，這可能與發(fā)酵環(huán)境的離子強(qiáng)度有關(guān)系，使得12g/100g(原料)的TSN和TCA-N的含量增加[20］。

2.1.3 對發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的影響

由圖8可以看出整個(gè)發(fā)酵過程中pH值的變化不甚明顯，高鹽濃度的pH值低于低鹽濃度的pH值。這也與蛋白酶活力大小以及氨基氮的溶出率有關(guān)。有機(jī)酸是發(fā)酵液的主要風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)酵過程中總酸含量的變化反映產(chǎn)酸微生物的變化情況，是發(fā)酵過程控制的要素之一。由圖9可知，各加鹽量處理下的總酸變化隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增后降的鐘形變化趨勢，發(fā)酵10 d后8 g/100 g(原料)加鹽量下的總酸含量最低，12 g/100 g原料加鹽量下的總酸最高。8 g/100 g(原料)鹽度下發(fā)酵液最后的pH值為5.77，12 g/100 g(原料)鹽度下的pH值為5.10。表明發(fā)酵前期，微生物生長產(chǎn)酸、產(chǎn)酶，pH值降低，酸度增加，后期隨著酶的水解，氨基酸增加，pH值增加，酸度降低。特別是低鹽下，腐敗菌產(chǎn)生揮發(fā)性氨類物質(zhì)，使得酸度急劇下降。綜上總酸呈現(xiàn)這種變化趨勢可能是發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)酸量和產(chǎn)生的堿性揮發(fā)性鹽基氮成分相互作用的結(jié)果[9］。

圖8 加鹽量對發(fā)酵過程中pH值的影響

圖9 加鹽量對發(fā)酵過程中總酸含量的影響

2.1.4 對發(fā)酵過程腐敗情況的影響

在魷魚廢棄物發(fā)酵過程中加鹽是為了抑制腐敗菌的生長，防止發(fā)酵液腐敗變質(zhì)。低鹽會使腐敗菌生長，產(chǎn)生各種揮發(fā)性氨類等物質(zhì)影響發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì);高鹽雖可抑制腐敗菌生長，但同時(shí)會抑制米曲霉的生長，延長發(fā)酵時(shí)間。在食品加工業(yè)中，通常采用TVBN值來檢測水產(chǎn)品的腐敗程度[21］。

由圖10知，整個(gè)發(fā)酵過程中，TVB-N的含量呈上升趨勢，4、8 g/100 g(原料)的加鹽濃度下，發(fā)酵后期的增加速度逐漸加快，4 g/100 g(原料)下表現(xiàn)最為明顯。12、16 g/100 g(原料)的加鹽量下發(fā)酵后期，TVB-N含量趨于平穩(wěn)。發(fā)酵10 d后，4、8、12、16 g/100 g(原料)的加鹽量下 T VB-N值分別為223.0，162.1，122.6，98.1 mg/100 mL。4 g/100 g(原料)加鹽量下的TVB-N值比其他3個(gè)加鹽量下的值明顯高出很多，這可能與體系中的水分活度有關(guān)，一般細(xì)菌的生長最低aW為9.4，所以在高鹽濃度下發(fā)酵液中腐敗細(xì)菌被抑制，從而降低了揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生[22］。4 g/100 g(原料)的加鹽量下發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液的感觀評定表明它的風(fēng)味明顯遜于其他3種加鹽量下的產(chǎn)物風(fēng)味，所以在后續(xù)的發(fā)酵中建議不選擇此加鹽量。

圖10 加鹽量對發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

2.1.4 對發(fā)酵過程中脂肪的影響

魚類的脂肪中富含大量的不飽和脂肪酸，這些不飽和脂肪酸極易被氧化產(chǎn)生哈喇味，除此之外還會影響到質(zhì)構(gòu)、色澤和營養(yǎng)價(jià)值[23］。經(jīng)檢測魷魚廢棄物中的脂肪含量為1.7%左右，所以考察發(fā)酵過程中脂肪氧化的變化顯得頗為重要。

圖11 加鹽量對脂肪的TBARS值的影響

脂肪氧化的終產(chǎn)物之一為丙二醛，丙二醛與硫代巴比妥酸(TBA)在一定條件下反應(yīng)產(chǎn)生紅色物質(zhì)(TBARS)，并在532 nm下有最大吸收峰，因此TBARS值的大小可用來表示脂肪受氧化的程度[24］。目前的科學(xué)研究中，也多用TBARS值來表征脂肪的氧化程度，因此實(shí)驗(yàn)考察了TBARS值的變化趨勢。

由圖11可以看出，魷魚加工廢棄物在發(fā)酵過程中TBARS值的變化趨勢:①高鹽濃度下TBARS值在第2～4天有個(gè)明顯的下降趨勢，低鹽濃度下，在第4～6天有明顯的下降趨勢，這可能與不同鹽濃度下蛋白質(zhì)的溶出程度有關(guān)，因?yàn)楸┛梢耘c蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使丙二醛呈結(jié)合狀態(tài)而不被檢測出來;②在整個(gè)發(fā)酵過程中，高鹽濃度下，TBARS值呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，低鹽濃度下，TBARS值變化緩慢，發(fā)酵后期趨于平穩(wěn)。Sikorski等研究表明，魚類保持高品質(zhì)所允許的TBARS值的最大值為5 mg/kg即5 μg/g[25］。發(fā)酵結(jié)束后，4、8、12、16 g/100g(原料)的加鹽量下 的TBARS值分別 為4.723、4.375、7.317和7.8855μg/g，高鹽濃度下發(fā)酵結(jié)束時(shí)的TBARS值超過了人的感官所能承受的范圍，所以建議發(fā)酵生產(chǎn)中不選擇此發(fā)酵條件。

圖12 加鹽量對游離脂肪酸含量的影響

圖13 加鹽量對酸價(jià)的影響

由圖12，圖13可以看出發(fā)酵過程中的游離脂肪酸含量和酸價(jià)的變化趨勢:(1)均保持上升趨勢，這與Tatterson和Windsord的研究結(jié)果相同[26］，這可能是因?yàn)橹驹诿傅淖饔孟滤獬鲋舅嵋约爸狙趸^程中產(chǎn)生了一些低分子的脂肪酸;(2)發(fā)酵后期它們的上升趨勢變得明顯，這說明游離脂肪酸在不斷的積累，酸價(jià)的變化趨勢也反映出了魷魚廢棄物的發(fā)酵過程漸近完全。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8 g/100 g(原料)鹽度下的氨基氮較高，而TVB-N較低，TBARS值較低，所以確定8 g/100 g(原料)鹽度為最適宜的發(fā)酵的加鹽量。

2.2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

為了揭示發(fā)酵過程的基本特征，預(yù)測發(fā)酵液中氨基酸含量，判知蛋白質(zhì)的水解程度，從而判斷發(fā)酵過程的完全與否，在確定加鹽量的基礎(chǔ)上，依據(jù)圖5米曲霉發(fā)酵產(chǎn)氨基氮曲線，采用Oringin7.5軟件對米曲霉的氨基酸生成進(jìn)行非線性曲線擬合。依據(jù)發(fā)酵特點(diǎn)采用曲線估計(jì)模型對氨基酸生成進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，擬合曲線如圖14所示。

圖14 不同NaCl添加量下的二項(xiàng)式擬合氨基酸生成量

表1 不同鹽度氨基酸生成模型參數(shù)

表1可以看出不同加鹽量下的擬合方程R2＞0.970，P＜0.05影響顯著，擬合程度高。適應(yīng)4～16 g/100 g(原料)的加鹽范圍內(nèi)的動(dòng)力學(xué)模型如下:

假設(shè)動(dòng)力學(xué)方程為Y=AT2+BT+C(Y:氨基氮濃度，A、B、C:模型參數(shù)，T:發(fā)酵時(shí)間)則A，B，C對加鹽量x(4～16g/100g(原料))的多項(xiàng)式擬合方程為[27-28］:

由方程知，A，B，C對加鹽量x的擬合方程R2＞0.9980，擬合精度高。

綜上發(fā)酵溫度控制30℃，不添加任何外源性蛋白酶，加鹽量在4～16 g/100 g(原料)的區(qū)間內(nèi)，氨基氮含量對發(fā)酵時(shí)間的擬合方程能夠很好的反映發(fā)酵過程的變化，從而指導(dǎo)實(shí)際的企業(yè)生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用控溫、加曲，低鹽殺菌等發(fā)酵方法進(jìn)行魷魚廢棄物的固態(tài)發(fā)酵。綜合考慮發(fā)酵過程中蛋白酶活、氨基酸態(tài)氮、總酸、TVB-N等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)8 g/100 g(原料)鹽度下氨基氮較高，TVB-N值較低，TBARS較低，確定8 g/100 g(原料)鹽度為最適宜的發(fā)酵的加鹽量。同時(shí)用ORIGIN7.5軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理計(jì)算，得到了氨基酸生成動(dòng)力學(xué)模型，在一定程度上揭示了發(fā)酵的基本特征，可以用來預(yù)測發(fā)酵液中氨基酸濃度，判斷發(fā)酵過程的正常與否，從而對發(fā)酵操作參數(shù)提出要求，以便加以控制，指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的優(yōu)化，為今后的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

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ABSTRACTThe study used solid-state fermentation technology with controlled temperature，koji，and low-salt sterilization to re-process squid wastes in order to reduce environmental pollution and use protein resources effectively.During the solid-state fermentation，protease activity，amino nitrogen content，total acid content，volatile basic nitrogen(TVB-N)content and so on were determined，to study the optimal fermentation process.The result shows that adding the amino nitrogen to 8g/100g raw material was the optimal fermentation process，and the TCA soluble nitrogen(TCA-N)，total soluble nitrogen(TSN)were higher，while TVB-N content and malondialdehyde content(TBARS values)were lower.We also used ORIGIN7.5 software to calculate the experimental data and obtained the dynamics model of producing amino acid nitrogen.

Key wordsaspergillus oryzae，salinity，squid wastes，solid-state fermentation

Study Salinity on Solid-state Fermentation of Squid Wastes and Its Kinetics

Zhang Jian-you，Jiang Yan-xi，Ding Yu-ting
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University ofTechnology，Hangzhou 310014，China)

博士研究生(丁玉庭教授為通訊作者)。

*浙江省科技廳科研社會發(fā)展項(xiàng)目“魷魚加工副產(chǎn)物的高值化開發(fā)利用與產(chǎn)業(yè)化”(2008C23021)

2010-01-21，改回日期:2010-03-29