外切異麥芽三糖水解酶的產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)*

岳曉婧，戴玲，夏強，汪晶晶

(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥，230039)

外切異麥芽三糖水解酶的產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)*

岳曉婧，戴玲，夏強，汪晶晶

(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥，230039)

從土壤中篩選出1株產(chǎn)外切型異麥芽三糖水解酶的黃綠青霉，可特異性地水解右旋糖酐只產(chǎn)生異麥芽三糖。該菌株產(chǎn)酶最優(yōu)條件為:培養(yǎng)液中淀粉、葡聚糖、NH4Cl、酵母膏的質(zhì)量分數(shù)分別為1%、1%、0.1%、0.1%，pH 6.0，接種量1%，裝液量50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速120 r/min。25℃培養(yǎng)13 d酶活達到176.80 U/mL。酶的最適作用溫度為55℃，在50℃半衰期為3 h，最適作用pH為6.5，在pH 4.0～pH 6.5范圍內(nèi)穩(wěn)定;金屬離子K+、Ba2+顯著促進酶活，Ca2+、Fe2+強烈抑制酶活;150 mmol/L NaCl所產(chǎn)生的離子強度促進酶活。

右旋糖酐酶，異麥芽三糖，青霉菌，酶學(xué)性質(zhì)

右旋糖酐(dextran)是某些細菌合成的生物高聚物，主要是葡萄糖通過α-1，6糖苷鍵連接而成的大分子，其在醫(yī)藥、食品及石油工業(yè)上有廣泛的應(yīng)用。已發(fā)現(xiàn)一些微生物能合成水解dextran的酶類，泛稱右旋糖酐酶(dextranases，dex)。依據(jù)催化反應(yīng)類型，右旋糖酐酶又可分為內(nèi)切酶和外切酶。內(nèi)切糖酐水解酶(EC3.2.1.11)隨機內(nèi)切水解dextran的1，6糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要是異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖和異麥芽寡糖的混合物，視產(chǎn)酶微生物的來源和右旋糖酐底物不同而有差別。外切酶是從右旋糖苷鏈的還原端或非還原端依次順序移去末端1～3個葡萄糖，產(chǎn)物分別為葡萄糖、異麥芽糖、異麥芽三糖，對應(yīng)的酶分別為葡萄糖右旋糖酐酶(glucodextranase，EC 3.2.1.70)，異麥芽糖右旋糖酐酶(isomaltodextranase，EC 3.2.1.94)和異麥芽三糖右旋糖酐酶(isomaltotriodextranase)(EC3.2.1.95)[1］。上述酶類分屬于糖苷酶數(shù)據(jù)庫中糖苷水解酶的不同家族(GH 49、66、13、15、27)[2］。

右旋糖酐酶有多方面的應(yīng)用，在防治齲齒，制糖工藝過程中葡聚糖的去除，以及酶解法生產(chǎn)低分子量的藥用右旋糖酐等方面有著重要用途[3-4］。右旋糖酐酶和右旋糖酐在構(gòu)建藥物載體和藥物釋放系統(tǒng)領(lǐng)域亦頗受關(guān)注[5-6］。右旋糖酐酶主要由微生物產(chǎn)生，包括絲狀真菌、細菌和酵母。目前對這些酶的研究以內(nèi)切右旋糖酐酶較為活躍，涉及Dex基因的克隆，酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究[7-8］，酶解產(chǎn)物為葡萄糖和寡糖的混合物。其他類型的酶報道較少。

異麥芽三糖右旋糖酐酶(isomaltotriodextranase)(EC3.2.1.95)最早由Sugiura報道[9］，是由褐色短桿菌產(chǎn)生的外切酶。該酶的底物特異性較強，只降解具有連續(xù)1，6糖苷鍵的dextran，產(chǎn)物為異麥芽三糖，又稱外切異麥芽三糖水解酶。該酶比較稀有，僅在少數(shù)細菌中發(fā)現(xiàn)，如Pulkownik[10］報道的鏈球菌內(nèi)切酶和程秀蘭[11］報道的產(chǎn)堿桿菌外切酶，其他尚未見報道。褐色短桿菌的產(chǎn)酶基因已克隆并在大腸桿菌中表達[12］，純化的重組酶表現(xiàn)出與天然酶相同的最適pH和作用方式。

該酶的底物特異性和產(chǎn)物均一性，使其能夠從右旋糖酐生產(chǎn)均一寡聚糖，具有潛在的應(yīng)用前景。本文首次報道從絲狀真菌發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)酶菌株，其酶解dextran產(chǎn)物經(jīng)薄層層析分析為單一的異麥芽三糖，證明為外切異麥芽三糖水解酶，并在前期工作基礎(chǔ)上對該菌產(chǎn)酶條件和粗酶性質(zhì)進行了研究。

1 材料

1.1 菌株

黃綠青霉D5菌株(Penicillium citreoviride)為實驗室保存菌株，篩選自土壤并經(jīng)形態(tài)及ITS rDNA序列鑒定。

1.2 主要試劑

Dextran T70(上海潤捷化學(xué)試劑有限公司);Blue Dextran 2000(Solarbio);Isomaltotriose(Sigma);Isomaltotetraose(USBiological);薄層層析板HPTLCPlatten Nano-sil 20(Merck)。

1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/100 mL):葡聚糖1、酵母膏0.2、NaNO30.2、NaH2PO40.05、K2HPO40.05、MgSO40.02、CaCl20.01、pH值自然。

2 方法

2.1 酶活力測定

將D5菌株搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液離心除去菌體后作為酶液。取10 μL適當稀釋的酶液，加入到90 μL用pH 5.0的醋酸緩沖液配制的2%葡聚糖溶液中，50℃反應(yīng)10 min，以100℃滅活5 min的酶液加底物溶液為反應(yīng)對照。反應(yīng)液DNS法測還原糖。在上述條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

2.2 產(chǎn)酶條件研究

2.2.1 碳源的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，采用葡聚糖及其分別與淀粉、葡萄糖、蔗糖的組合作為碳源，25℃搖床培養(yǎng)72 h，測酶活。過濾菌絲球，蒸餾水洗滌后烘干稱重測生物量。

2.2.2 氮源的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，采用最優(yōu)碳源，以酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4Cl作氮源，搖床培養(yǎng)72 h，測酶活和生物量。

2.2.3 初始pH的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別采用最優(yōu)碳氮源，調(diào)節(jié)初始pH值分別為pH 3～8，25℃搖床培養(yǎng)72 h，測酶活。

2.2.4 裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量的影響

根據(jù)單項預(yù)試驗結(jié)果，選擇影響真菌液態(tài)發(fā)酵的3個重要因素:裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量進行正交實驗L9(33)得出產(chǎn)酶最佳條件。

表1 正交優(yōu)化因素水平表

2.2.5 產(chǎn)酶時間曲線

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基，接種后于25℃搖床培養(yǎng)，每隔24 h測酶活。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 酶促反應(yīng)產(chǎn)物分析

將酶液加入到2%葡聚糖溶液中，50℃反應(yīng)30 min后，煮沸5 min中止反應(yīng)，反應(yīng)液用薄層色譜法分析。展層劑為V(甲酸)∶V(正丁醇)∶V(水)=6∶4∶1，顯色劑為1 mL HCl、2 mL苯胺、2 g二苯胺、10 mL 85%H3PO4溶于100 mL丙酮中。

2.3.2 最適作用溫度及熱穩(wěn)定性

將粗酶液與底物溶液分別在25～65℃條件下反應(yīng)10 min后測酶活，研究最適作用溫度;將酶液分別于25～60℃保溫，每隔一定時間取樣1次，取出的樣品立即冰浴，在最適作用溫度下測酶活，測量酶的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 最適作用pH及pH穩(wěn)定性

在pH 3.6～10.0的不同緩沖液中測酶活力研究最適作用pH;用pH 4.0～9.0的緩沖液將酶液稀釋2倍，于4℃保存6 h后測酶活，研究pH穩(wěn)定性。

2.3.4 金屬離子對酶活的影響

用底物溶液分別配制K+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+溶液，使各金屬離子終濃度分別為5，10，20 mmol/L。以不加金屬離子的反應(yīng)體系為對照，在最適反應(yīng)條件下測酶活。

2.3.5 離子強度對酶活的影響

用底物溶液分別配制濃度在50～300 mmol/L的NaCl溶液，以不加NaCl的反應(yīng)體系為對照，在最適反應(yīng)條件下測酶活。

3 結(jié)果與分析

3.1 青霉D5產(chǎn)酶條件研究

3.1.1 碳源的影響

可溶性碳源對產(chǎn)酶有較明顯的影響(圖1)。單一碳源組中，葡聚糖作碳源時酶活最高，蔗糖和葡萄糖作碳源時產(chǎn)酶較低。加葡聚糖的組合碳源組產(chǎn)酶分別比相應(yīng)的單一碳源組高，且隨著葡聚糖含量增加產(chǎn)酶提高，證明葡聚糖對菌株的產(chǎn)酶有誘導(dǎo)作用。組合碳源中，1%淀粉+1%葡聚糖對促進產(chǎn)酶效果最好，1.5%蔗糖+0.5%葡聚糖促產(chǎn)酶的效果最差。從生物量上看，單一碳源組中葡聚糖作碳源時生物量最低，組合碳源組的生物量普遍比相應(yīng)的單一碳源組低，說明葡聚糖不易被該菌株利用。生物量與產(chǎn)酶無相關(guān)性。

3.1.2 氮源的影響

氮源對產(chǎn)酶的影響見圖2。0.1%NH4Cl+0.1%酵母膏作氮源時菌株產(chǎn)酶最高，其次為0.2%NH4Cl，且這2組生物量最高，說明NH4Cl對該菌株的菌體生長和產(chǎn)酶有促進作用。

3.1.3 初始pH值的影響

調(diào)整培養(yǎng)基至不同pH值，測上清液中酶活，結(jié)果見圖3。

圖1 碳源對產(chǎn)酶的影響

圖2 氮源對產(chǎn)酶的影響

圖3 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

3.1.4 裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量的影響

從預(yù)試驗研究發(fā)現(xiàn)，裝液量、轉(zhuǎn)速和接種量3因素對該菌株產(chǎn)酶影響較大，若裝液量過高，搖瓶內(nèi)溶氧不能滿足該菌發(fā)酵產(chǎn)酶的需要;若過低則營養(yǎng)物質(zhì)減少，酶活同樣達不到最大值;對于絲狀真菌，轉(zhuǎn)速若過高，菌體不易形成菌絲球，若過低則通氣量低不適宜生長。因此在單因素試驗基礎(chǔ)上用正交方法對其進行優(yōu)化。根據(jù)L9(33)正交實驗結(jié)果的極差值分析，各因素對D5產(chǎn)Dex影響大小依次為轉(zhuǎn)速，裝液量，接種量;最佳組合為轉(zhuǎn)速120 r/min，裝液量50 mL/250 mL，接種量0.5 mL(1%)。

3.1.5 產(chǎn)酶時間曲線

產(chǎn)酶時間曲線(圖4)表明，菌株在培養(yǎng)初始產(chǎn)酶增加，至3 d達到短暫的高峰(73.47 U/mL)后開始下降，至6 d產(chǎn)酶再一次迅速上升，13 d上升至最大值(176.80 U/mL)。因此，以培養(yǎng)13 d為宜，菌株至1 w左右次生代謝產(chǎn)物積累產(chǎn)酶快速上升。

圖4 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

3.2 Dex酶學(xué)性質(zhì)研究

3.2.1 Dex酶解產(chǎn)物分析

酶液催化底物Dextran T70后，采用薄層層析法分析降解的產(chǎn)物，并以標準低聚糖作陽性對照，結(jié)果如圖5所示，根據(jù)遷移率的比較判定，酶解產(chǎn)物僅有異麥芽三糖，分析該右旋糖酐酶為外切型異麥芽三糖水解酶。

圖5 酶解產(chǎn)物的薄層層析圖譜

3.2.2 最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性

以所測最高酶活為100%，圖6，圖7表明，D5產(chǎn)Dex酶在反應(yīng)溫度55℃下酶活最高，至65℃酶活降至先前的63%;在25～40℃有較好的熱穩(wěn)定性;在50℃酶的半衰期為3 h;在55℃只能保存10 min，保溫20 min時酶活降至38%。由此可見該酶可以在55℃有最高的催化效率，只能維持10 min。

3.2.3 最適作用pH值及pH值穩(wěn)定性

圖6 酶的最適溫度

圖7 酶的熱穩(wěn)定性

圖8 ，圖9表明，該Dex酶在酸性條件下酶活較高，pH值6.5時酶活最高;在pH值4～6.5維持83%以上酶活，在pH 5.5時穩(wěn)定性最好。在最適作用pH值下有良好的穩(wěn)定性。

圖8 酶的最適pH值

圖9 酶的pH值穩(wěn)定性

3.2.4 金屬離子對酶活的影響

以不加金屬離子所測酶活為100%，測定了5種金屬陽離子對酶活的影響，結(jié)果見圖10。K+和低濃度的Ba2+對酶活有顯著的促進作用;高濃度的Ca2+、Fe2+明顯抑制酶活;5 mmol/L的Mg2+對酶活力有促進作用，但隨離子濃度增大，酶活下降。

圖10 金屬離子對酶活的影響

3.2.5 離子強度對酶活的影響

不同濃度NaCl所產(chǎn)生的離子強度對酶活的影響見圖11。低濃度的離子對酶活有促進作用，從150 mmol/L起酶活緩慢下降，高濃度的離子抑制酶活。

圖11 NaCl離子濃度對酶活的影響

4 結(jié)論

本實驗分離出的D5菌株為未見報道的產(chǎn)外切異麥芽三糖水解酶的真菌，經(jīng)形態(tài)和分子鑒定為黃綠青霉(另文發(fā)表)。經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化后培養(yǎng)13 d酶活可達到176.80 U/mL。該酶底物專一性很強，對普魯藍糖、淀粉和羧甲基纖維素底物沒有作用(結(jié)果未列)，說明只水解連續(xù)的α-1，6糖苷鍵。

許多文獻均報道Dex為誘導(dǎo)酶，使用其他可溶性碳源時菌株不產(chǎn)酶或無法高產(chǎn)。Garcia等人證明碳源對Dex酶合成的調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平上。mRNA豐度顯示了葡聚糖在轉(zhuǎn)錄水平上促進Dex基因的表達;而當在培養(yǎng)基中同時加入葡聚糖與葡萄糖時，Dex基因的轉(zhuǎn)錄滯后了24 h[13］。提示酶的合成受底物葡聚糖的誘導(dǎo)和葡萄糖的阻遏作用雙重調(diào)控。Khalikova[1，14］認為，在dexA基因的5＇非編碼區(qū)存在一些序列，其與構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)葡萄糖阻遏因子CRE A的結(jié)合位點相似，有可能受到CRE A同源物的調(diào)控。一些產(chǎn)Dex酶菌株的產(chǎn)酶量普遍受到葡萄糖的抑制。但也有例外，Arnold[15］報道申克孢子絲菌(Sporotrix schencki)在用葡萄糖替換葡聚糖作碳源的條件下，產(chǎn)酶提高10倍。

本試驗中葡聚糖對D5菌株的產(chǎn)酶有誘導(dǎo)作用，僅使用淀粉、葡萄糖、蔗糖作碳源時菌株產(chǎn)酶明顯下降。與大多數(shù)已報道菌株不同的是，1%葡萄糖對D5菌株的產(chǎn)酶沒有明顯阻遏作用，相反1%葡萄糖加1%葡聚糖組合碳源產(chǎn)酶甚至比單獨2%葡聚糖作碳源高?？赡苁巧倭科咸烟怯欣诰昶鹗忌L，增加生物量，因此產(chǎn)酶優(yōu)于全葡聚糖作碳源。又由于該酶外切葡聚糖特異性地產(chǎn)生異麥芽三糖，不會增加培養(yǎng)液的葡萄糖濃度，不同于一些文獻報道的菌株，其酶解產(chǎn)物是葡萄糖，容易產(chǎn)生阻遏效應(yīng)。

[1]Khalikova E，Susi P，Korpela T.Microbial dextran-hydrolyzing enzymes:fundamentalsand applications[J］.Micorobiology and Molecular Biology Reviews，2005，69(2):306-325.

[2]Aoki H，Sakano Y.A classification of dextran-hydrolyzing enzymes based on amino-acid-sequence similarities[J］.Biochem，1997，323:859-861.

[3]Eggleston G，Monge A.Optimization of sugarcane factory application of commercial dextranases[J］.Process Biochemistry，2005，40:1881-1189.

[4]蔣丹，仇元新，胡濤，等.口腔鏈球菌右旋糖酐酶分子結(jié)構(gòu)和功能的研究進展[J］.國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008(3):249-251.

[5]Basan H，Gumusderelioglu M，Tevfik O M.Release characteristics of salmon calcitonin from dextran hydrogels for colon-specific delivery[J］.Eur J Pharm Biopharm，2007，65(1):39-46.

[6]Pitarresi G，Casadei M A，Mandracchia D.Photocrosslinking of dextran and polyaspartamide derivatives:a combination suitable for colon-specific drug delivery[J］.J Control Release，2007，119(3):328-338.

[7]Finnegan P M，Brumbley S M，O＇Shea M G，et al.Isolation and characterization of genes encoding thermoactive and thermostable dextranases from two thermotolerant soil bacteria[J］.Current Microbiology，2004，49:327-333.

[8]Kang H K，Kim S H，Park J Y，et al.Cloning and characterization of a dextranase gene from Lipomyces starkeyi and its expression in Saccharomyces cerevisiae[J］.Yeast，2005，22:1239-1248.

[9]Sugiura M，Ito A，Yamaguchi T.Studies on dextranase II.New exo-dextranase from Brevibacterium fuscum var dextranlyticum[J］.Biochim Biophys Acta，1974，350:61-70.

[10]Pulkownik A，Walker G J.Purification and substrate specificity of an endo-dextranase Streptococcus mutans K1-R[J］.Carbohydr Res，1977，54:237-251.

[11]程秀蘭，凌嵩，楊敬，等.產(chǎn)堿菌外切異麥芽三糖水解酶的產(chǎn)生和性質(zhì)[J］.微生物學(xué)報，1994，34(2):124-130.

[12]Mizuno T，Mori H，Ito H，et al.Molecular cloning of isomaltotrio-dextranase gene from Brevibacterium fuscum var.dextranlyticum strain 0407 and its expression in Escherichia coli[J］.Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(9):1582-1588.

[13]Garcia B，Rodriguez E.Carbon source regulation of a dextranase gene from the filamentous fungus Penicillium minioluteum[J］.Current Genetics，2000，37(6):396-402.

[14]Dowzer C E A，Kelly J M.Analysis of the CreA gene from Aspergillus nidulans:a gene involved in carbon catabolite repression[J］.Molecular and Cellular Biology，1991，11:5701-5709.

[15]Arnold W N，Nguyen T B P，Mann LC.Purification and characterization of a dextranase from Sporothrix schenckii[J］.Arch Microbiol，1998，170:91-98.

ABSTRACTA strain of Penicillium citreoviride was screened from soil to produce exo-isomaltotriodextranase，which specifically released isomaltotriose as main products from dextran T70.The optimum condition for Isomaltotriodextranase production consisted of 1%starch，1%dextran，0.1%NH4Cl and 0.1%yeast extract，the initial pH for 6.0，1%inoculating quantity，rate of shaking flask with 50 mL liquid in a 250 mL flask was 120 r/min.After fermentation for 13 days at 25℃，the enzyme activity was 176.80 U/mL.The enzyme displayed maximum activity at 55℃.The half-life of the enzyme was3h at 50℃.The optimum pH was pH 6.5，and the enzyme activity was stable from pH4.0～6.5.The enzyme was enhanced by K+and Ba2+，but was inhibited by Ca2+，F(xiàn)e2+.The enzyme activity could be improved by the ionic strength of NaCl at 150 mmol/L.

Key wordsdextranase，isomaltotriose，Penicillium，enzymatic character

Conditions for Enzyme Production and Enzymatic Characters of Exo-isomaltotriodextranase

Yue Xiao-jing，Dai Ling，Xia Qiang，Wang Jing-jing
(School of Life Science，Anhui University，Hefei 230039，China)

碩士研究生(戴玲為通訊作者，E-mail:dailing2@ah163.com)。

*安徽大學(xué)211工程學(xué)術(shù)創(chuàng)新團隊資助項目(02203109)

2010-01-08，改回日期:2010-04-22