食用百合試管苗緩慢生長保存的研究

張玉芹 馮建軍 趙景芳

（1內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028043；2興安盟科右中旗農(nóng)業(yè)局，內(nèi)蒙古科右中旗 029400；3內(nèi)蒙古興安盟突泉縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古興安盟 137500）

食用百合試管苗緩慢生長保存的研究

張玉芹1馮建軍2趙景芳3

（1內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028043；2興安盟科右中旗農(nóng)業(yè)局，內(nèi)蒙古科右中旗 029400；3內(nèi)蒙古興安盟突泉縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古興安盟 137500）

為了建立食用百合種質(zhì)資源緩慢生長保存體系，將擴繁培養(yǎng)后得到的試管苗接種到12種不同培養(yǎng)基中，10 ℃和25 ℃下分別保存6個月，觀察不同處理試管苗生長情況。結(jié)果表明:低濃度甘露醇對百合試管苗生長的抑制效果差，而高濃度甘露醇嚴重影響其生長勢，緩慢生長保存的最適濃度為20 g·L-1；蔗糖對百合試管苗的生長有抑制作用，適宜濃度為60 g·L-1；20 g·L-1甘露醇+60 g·L-1蔗糖處理的百合試管苗存活率均達100 %，且有鱗莖形成，保存效果最好。10 ℃保存的試管苗生長緩慢，有利于鱗莖形成，保存至6個月時不需要繼代培養(yǎng)；25 ℃保存試管苗的鱗莖形成率低，培養(yǎng)基損失量高，必須繼代才能繼續(xù)保存。

食用百合；試管苗；緩慢生長

食用百合有很高的食用價值，是菜中珍品，其肥厚的鱗片含有豐富的淀粉和蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、果膠質(zhì)，VB1、胡蘿卜素的含量也較豐富，還含有鈣、磷、鋅、鐵、硒等13種微量元素和18種氨基酸（盧美嬌，2001；馬云光和鄧成忠，2002）。百合栽培一般采用分球繁殖，用種量大，生長周期長；鱗片扦插易腐爛，成活率低，容易感染病毒，造成品種退化，從而影響產(chǎn)品品質(zhì)（岳雷，2005）。緩慢生長保存植物種質(zhì)資源是近年來新發(fā)展起來的，較為有效的種質(zhì)保存方法:以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過改變試管苗的生長環(huán)境，使細胞生長降至最小限度，延長繼代間隔時間，減少繼代次數(shù)，以避免頻繁繼代造成污染或引發(fā)種質(zhì)變異。具有保存時間長，占空間少，利用時可直接播種入土壤，操作簡便，節(jié)省費用，且安全、可靠、無病蟲為害等優(yōu)點，尤其適用于無性繁殖的作物（周遜和向長萍，2008）。該技術(shù)已應(yīng)用于馬鈴薯、甘薯、草莓、大蒜、生姜、胡蘿卜等作物（Westcott，1981；Withers，1986；徐培文 等，2002；莊飛云 等，2005；趙密珍 等，2006；周遜 等，2008），但通過緩慢生長保存食用百合種質(zhì)資源的研究卻鮮見報道。本試驗以蘭州百合〔Lilum davidiiDuch. var.unicolor（Hoog）Cotton〕為試材，探討溫度、甘露醇及蔗糖濃度對百合試管苗緩慢生長的影響，以期為保存百合種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為蘭州市場上購買的2008年收獲的新鮮蘭州百合。

1.2 試驗方法

MS+IAA0.05 mg·L-1+6-BA0.1 mg·L-1培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化形成的小苗，經(jīng) MS+NAA0.1 mg·L-1+6-BA0.25 mg·L-1培養(yǎng)基擴繁后繼代培養(yǎng)一段時間，待長成15～25 mm長的幼苗后，接種在不同培養(yǎng)基上（表1），分別在（10±1）℃和（25±1）℃下保存，光照時間為每天8 h，光照強度為6130 lx（560 FC）。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種3瓶，共9瓶，每瓶5株試管苗，同時做空白培養(yǎng)基計算培養(yǎng)基損失量，每處理3瓶。

保存期間，測定培養(yǎng)基的質(zhì)量，觀察試管苗的生長狀況和基部是否有鱗莖發(fā)生，測量試管苗的株高。為防止污染，試管苗株高是用直尺直接在三角瓶外測定。

表1 試管苗緩慢生長保存培養(yǎng)基設(shè)計 g·L-1

2 結(jié)果與分析

2.1 試管苗成活率

由表2可以看出，不同處理試管苗，10 ℃下保存3個月時，存活率均為100 %，保存6個月時，除SN2、SN4、SN5和SN6外，其他處理的試管苗均有不同程度枯死，其中CK3蔗糖濃度為90 g·L-1且未添加甘露醇的試管苗存活率最低，只有79.6 %。甘露醇和蔗糖濃度對試管苗存活率均有影響:SN4、SN5和SN6甘露醇濃度為20 g·L-1的試管苗存活率最高，達100 %；SN8蔗糖濃度為60 g·L-1時，試管苗的存活率較高，蔗糖濃度過高存活率下降。

25 ℃下保存3個月時，不同處理的試管苗開始出現(xiàn)枯死現(xiàn)象。SN4和SN5甘露醇濃度20 g·L-1試管苗存活率為100 %，SN8蔗糖濃度60 g·L-1時，試管苗存活率為100 %，甘露醇濃度和蔗糖濃度過高試管苗的存活率均下降。保存6個月時，SN5（20 g·L-1甘露醇+60 g·L-1蔗糖）試管苗存活率為100 %，其他處理的試管苗均有不同程度死亡。

表2 不同處理保存試管苗平均成活率及株高增量

2.2 試管苗株高變化

從表2可知，10 ℃下保存的試管苗在保存1個月時生長很緩慢，除CK1、CK2和SN4外，其他處理株高增加量均不到1 cm，且生長健壯。第1～3個月試管苗生長較快，保存到3個月時，CK1株高增量最大，為3.11 cm，但葉尖有輕度枯死，SN9株高增量最小，只有0.27 cm。蔗糖濃度越高株高增量越小，說明蔗糖可明顯抑制試管苗的生長，甘露醇濃度對株高的影響不及蔗糖濃度，但也表現(xiàn)為隨著濃度增高抑制作用增強的趨勢。保存到6個月時，試管苗增長緩慢，未添加甘露醇的處理株高增量最小，但試管苗葉尖枯死較嚴重，SN5（60 g·L-1蔗糖+20 g·L-1甘露醇）處理的增量小且未出現(xiàn)葉尖枯死。

25 ℃下保存的試管苗株高較10 ℃下保存的試管苗增長快，對蔗糖及甘露醇的反應(yīng)與10℃下保存的趨勢基本相同，蔗糖濃度及甘露醇濃度過高導(dǎo)致試管苗枯死，CK3葉尖枯死最為嚴重，甘露醇濃度超過20 g·L-1時葉尖也出現(xiàn)枯死。25℃下保存的試管苗仍表現(xiàn)為甘露醇濃度20 g·L-1+糖濃度60 g·L-1時保存效果最好。

2.3 緩慢保存試管苗微型鱗莖形成狀況

由表3可知，在10 ℃下保存3個月，除SN1和CK1外，其他處理試管苗均有微型鱗莖形成，SN5形成率最高，為68.9 %；保存6個月時各處理及對照均有微型鱗莖形成，SN3、SN5和SN8形成率均超過80 %，其中SN5達到了93.3 %。

25 ℃下保存的試管苗在保存1個月時部分處理就有微型鱗莖出現(xiàn)，以SN5的形成率最高，為24.4 %，而培養(yǎng)基中蔗糖濃度較低的SN1、SN4、SN7和CK1均未有微型鱗莖形成。保存6個月后，SN1、SN4、SN7和CK1仍未有微型鱗莖出現(xiàn)，SN5的鱗莖形成率仍最高，同一處理的鱗莖形成率均低于10 ℃保存6個月的鱗莖形成率，表明在一定范圍內(nèi)，提高蔗糖濃度降低保存溫度有利于蘭州百合試管苗的鱗莖形成。

2.4 試管苗培養(yǎng)基損失量

由表3可以看出，10 ℃下保存1個月，培養(yǎng)基損失量均很低，未超過2 %；隨著保存時間延長，培養(yǎng)基損失量增加，3個月時CK1損失量最大，為6.92 %，SN6損失量最小，為4.34 %；保存6個月時，CK1損失量最大，為12.40 %；10 ℃下保存試管苗6個月不需要更換培養(yǎng)基。25 ℃下保存試管苗培養(yǎng)基保存1個月時損失量均超過5 %，保存6個月時損失量超過20 %，損失量最大的為CK1，達31.54 %，最小的為SN9，達20.21 %，如作保存培養(yǎng)基需繼代才能繼續(xù)保存。

表3 不同處理保存試管苗微型鱗莖形成率及培養(yǎng)基損失量

3 結(jié)論與討論

3.1 溫度對試管苗保存的影響

降低培養(yǎng)溫度是植物組織培養(yǎng)物緩慢生長保存最常用的方法（徐剛標，2000），野葛常溫下保存180 d后成活率為80 %，4 ℃低溫下保存180 d后成活率可達98 %（洪森榮 等，2007）。本試驗將百合試管苗在2種溫度條件下培養(yǎng)，結(jié)果表明，10 ℃的低溫條件下培養(yǎng)6個月，試管苗不需要更換培養(yǎng)基可繼續(xù)保存，且低溫有利于微型鱗莖的形成；25 ℃下保存的試管苗3個月就出現(xiàn)葉尖枯死，6個月后培養(yǎng)基損失量大，需要更換培養(yǎng)基才能繼續(xù)保存。因此，降低培養(yǎng)溫度可顯著降低百合試管苗生長速度，減少其繼代次數(shù)，節(jié)省人力、物力，使其得以較長期的保存。

3.2 生長抑制劑對試管苗保存的影響

甘露醇能減小細胞膨壓，使養(yǎng)分和水分吸收困難，從而抑制植株生長，減少養(yǎng)分消耗，具有延長植株保存期限的作用（Dorion et al.，1994）；香草在添加15 g·L-1甘露醇培養(yǎng)基上保存，只需每年繼代1次即可（Divakaran et al.，2006）；在添加1 %～3 %甘露醇的MS培養(yǎng)基上，淡黃花百合組培苗保存10個月后存活率為92 %左右（李黛 等，2006）；辛淑英和謝欣（1995）研究得出2 %甘露醇處理保存的百合試管苗效果最好。本試驗中，10 ℃下保存在添加甘露醇培養(yǎng)基試管苗，6個月后不需要繼代而繼續(xù)保存，且試管苗生長健壯；25 ℃下保存的百合試管苗，在加有甘露醇的培養(yǎng)基中保存6個月，轉(zhuǎn)到新鮮培基上仍能成活，甘露醇濃度為20 g·L-1時效果最好。

糖類物質(zhì)是試管苗生存和生長的主要碳源（史永忠 等，1996）。添加蔗糖后，咖啡試管苗保存2 a大大提高了成活率，但濃度過高，植株吸水困難，也會導(dǎo)致不良后果（Kartha et al.，1981）。陳輝等（2006）研究百合種質(zhì)資源限制生長法保存時得出，培養(yǎng)基中添加高濃度蔗糖會限制其生長，隨著蔗糖濃度的升高，抑制作用逐漸加強，但高濃度的糖會增加試管苗死亡率，蔗糖濃度達到90 g·L-1以上時出現(xiàn)死亡。本試驗結(jié)果表明，蔗糖濃度在60 g·L-1時保存的百合試管苗效果最好。

3.3 試管苗保存的可行性

建立在植物微繁基礎(chǔ)上的試管苗緩慢生長保存，其目的是降低試管苗的生長速度，從而建立試管苗種質(zhì)庫，達到中長期保存。緩慢生長保存的試管苗可隨時轉(zhuǎn)入繁殖，不需長時間恢復(fù)，這對快速繁殖十分有用。在年周期中，并非任何時候都適于進行快繁；市場對品種的需求也是變化莫測的。因此，有必要對一些試管材料進行中短期的保存，在這種情況下，試管緩慢生長保存是較為合適的保存方法。在本試驗中，由百合鱗片誘導(dǎo)培養(yǎng)出來的試管苗在10 ℃低溫下不經(jīng)繼代遮光保存6個月，長勢良好，SN2、SN5和SN6處理存活率達到100 %。說明利用這一途徑對百合種質(zhì)資源進行中短期保存是可行的。但要在實踐中運用還有許多需要完善的地方，如:關(guān)于百合低溫保存生理的研究、百合低溫保存后遺傳變異的檢測等。

陳輝，陳曉玲，陳龍清，盧新雄.2006.百合種質(zhì)資源限制生長法保存研究.園藝學(xué)報，33（4）:789-793.

洪森榮，尹明華，柯維忠，黃永福，王忠敏，張莉華.2007.PP333對野葛離體保存的影響.上饒師范學(xué)院學(xué)報，27（6）:68-72.

李黛，曾艷玲，魏福倫.2006.淡黃花百合的離體保存.貴陽學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，1（3）:45-47.

盧美嬌.2001.藥用百合與食用百合的區(qū)別.時珍國醫(yī)國藥，12（9）:806.

馬云光，鄧成忠.2002.食用百合高產(chǎn)栽培技術(shù).中國果菜，（1）:23.

史永忠，鄧秀新，萬蜀淵，薛光榮.1996.蘋果種質(zhì)資源的離體保存.作物品種資源，（4）:42-44.

辛淑英，謝欣.1995.甘露醇濃度對百合種質(zhì)離體保存的影響.作物品種資源，（3）:50-52.

徐剛標.2000.植物種質(zhì)資源離體保存研究進展.中南林學(xué)院學(xué)報，20（4）:81-87.

徐培文，曲士松，劉恒英，張杰，孫晉斌，黃寶勇.2002.中國大蒜種質(zhì)資源離體保存初步研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，35（3）:314-319.岳雷.2005.淺談食用百合的應(yīng)用和栽培技術(shù).中國果菜，（5）:53.

趙密珍，王壯偉，錢亞明，蘇家樂，袁驥.2006.不同培養(yǎng)基對草莓種質(zhì)離體保存的影響.果樹學(xué)報，23（1）:27-30.

周遜，李錫香，向長萍，王海平，沈鏑.2008.生姜種質(zhì)資源的常溫離體保存.遵義師范學(xué)院學(xué)報，8（4）:50-53.

周遜，向長萍.2008.植物種質(zhì)資源緩慢生長離體保存研究進展.中國蔬菜，（11）:39-42.

莊飛云，趙志偉，廖開志，王翠.2005.常低溫離體保存胡蘿卜種質(zhì)資源研究初探.中國蔬菜，（3）19-20.

Divakaran M，Babu K N，Peter K V.2006.Conservation of Vanilla species，in vitro.Scientia Horticulturae，110:175-180.

Dorion N，Regnard J L，Serpette I，Bigot C.1994.Effects of temperature and hypoxic atmosphere on preservation and further development of in vitro shoot of peach（‘Armking’）and peach×almondhy-hybrid（‘GF677’）.Scientia Horticulturae，57（3）:201-213.

Kartha K K，Mroginski L A，Pahl K，Leung N L.1981.Germplasm preservation of coffee（Coffea arabica L.）by in vitro culture of shoot apical meristems.Plant Sci Lett，22（4）:301-307.

Westcott R J.1981.Tissue culture storage of potato germplasm.2.use of growth retardants minimal growth storage.Potato Research，24:343-352.

Withers L A.1986.Cryopreservation and genebanks.Plant Cell Culture Technology:6-140.

Studies on Edible Lily in vitro Conservation Technique by Slow-growth Method

ZHANG Yu-qin1, FENG Jian-jun2, ZHAO Jing-fang3
（1College of Agronomy, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao028043, Inner Mongolia, China;2Agriculture Bureau of Xinganmeng, Keyouzhongqi029400, Inner Mongolia, China; 3Agricultural Technology Extension Center of Tuquan County, Xinganmeng137500, Inner Mongolia, China）

In order to establish conservation system for edible lily slow-growth germplasm resources,the test-tube plantlets gained from micro-propagation were inoculated in12 different culture media and conserved under10 ℃ and25 ℃ for6 months, respectively, so as to observe the growth of test-tube plantlets under different treatments. The results showed that the low mannitol concentration has poor control affect on the growth of test-tube plantlets, while the high concentration severely affect the plantlets growth. The suitable mannitol concentration was20 g·L-1for conserving edible lily plantlets with slow-growth. Sucrose has restrain effect on the growth of test-tube plantlet,60 g·L-1sucrose is the suitable media.20 g·L-1mannitol+60 g·L-1sucrose is the best treatment for slow growth conservation of edible lily test-tube plantlets. Their survival rate can reach100 %, and the rate of bulb formation is high.10 ℃ can keep the plantlet grow slowly and promote the bulb formation for6 months conservation without subculture, while under25 ℃ the rate of bulb formation is reduced, and the medium loss is serious. The plantlets must be preserved with subculture.

Edible lily; Test-tube plantlet; Slow-growth

S644.1

A

1000-6346（2010）24-0069-05

2010-09-16；接受日期:2010-10-16

張玉芹，女，博士，講師，主要從事無性繁殖蔬菜種質(zhì)保存研究工作，E-mail:zhyq369@126.com