鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

馬志偉，劉世超，許家榮，許俊才

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210000)

鴨疫里默氏桿菌病，又稱為鴨疫綜合征、鴨敗血癥、鴨傳染性漿膜炎和鴨疫巴氏桿菌感染，是由鴨疫里默氏桿菌 (Riemerella anatipestifer，RA)引起的鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種急性或慢性敗血性傳染?。?］，是目前對世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成危害最為嚴(yán)重的傳染病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病最早由Riemer于1904年報道發(fā)生在鵝群中;1932年，美國學(xué)者 Hendrikson和 Hibert報道在紐約長島的鴨場中發(fā)現(xiàn);在我國，1975年鄺榮祿等首次報道該病在廣州存在。1982年郭玉璞等從北京郊區(qū)鴨場首次分離到RA以來，河南、福建、四川等地均相繼報道了RA感染，近年來該病依然普遍流行［2］。

RA主要感染1～8周齡鴨，尤其是2～3周齡雛鴨，此外也感染鵝和雞等禽類，其流行無明顯的季節(jié)性。一年四季均可發(fā)生，冬季和春季發(fā)病相對較多，夏季相對較少。本病的發(fā)生和飼養(yǎng)管理條件等因素有關(guān)，主要通過污染的飼料、飲水、飛沫、塵土等經(jīng)呼吸道和損傷的皮膚，尤其是腳蹼受傷等途徑以水平方式傳播，低溫陰雨、潮濕、寒冷的環(huán)境易誘發(fā)本病的發(fā)生，如飼養(yǎng)密度過大、通風(fēng)不良、衛(wèi)生條件差、轉(zhuǎn)舍時受寒冷或雨淋的刺激等均可引起該病暴發(fā)流行，加劇該病的發(fā)生和病鴨死亡［3］。該病的發(fā)病率可達(dá)90%以上，死亡率一般在5%～75%之間。迄今為止，國際上共報道RA有 21 個血清型 (1 ～21 型)［4-7］。

2009年4月江蘇省南京市郊區(qū)某種鴨場15日齡的櫻桃谷小鴨爆發(fā)疑似鴨疫里默氏桿菌病的疫情，全場90%小鴨發(fā)病，死亡率達(dá)45%，損失嚴(yán)重。我們對該病進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

從發(fā)病鴨中選擇具有典型臨床癥狀、剖檢具有典型心包炎、肝周炎等鴨疫里默氏桿菌病典型癥狀的病鴨。

1.1.2 培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板、血瓊脂平板、胰酶大豆瓊脂平板 (TSA)、胰酶大豆培養(yǎng)基(TSB)。

1.1.3 試劑

革蘭氏染液、瑞氏染液;微量生化發(fā)酵管;初生牛血清;鴨疫里默氏桿菌1、2型陽性血清 (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院韋強研究員惠贈)。

1.1.4 試驗動物

從養(yǎng)鴨場選購未免疫健康雛鴨，品種:櫻桃谷鴨。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采取患病雛鴨的心血、肝臟、氣囊、腦等組織及滲出物，分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、TSA平板、麥康凱平板、血瓊脂平板上，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。再將典型疑似菌落進(jìn)一步劃線接種于TSA平板上，進(jìn)一步做純化培養(yǎng)。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察

將分離到的細(xì)菌挑取單個菌落劃線接種于血瓊脂平板和TSA平板上，觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 染色鏡檢

按常規(guī)方法對典型疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色和瑞士染色，鏡檢。

1.2.4 生理生化試驗

無菌鉤取分離細(xì)菌純培養(yǎng)物少許，接種于微量生化發(fā)酵管中，分別做麥芽糖、果糖、棉子糖、木糖、側(cè)金盞花醇、山梨醇、甘露醇發(fā)酵利用試驗、吲哚試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、產(chǎn)硫化氫試驗、脲酶試驗、硝酸鹽還原試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、氨基酸脫羧酶試驗、MR試驗、VP試驗、明膠液化試驗。

1.2.5 血清學(xué)鑒定

挑取平板上的單個菌落接種于TSA培養(yǎng)平板，置37℃培養(yǎng)36 h，按常規(guī)方法做玻片凝集試驗。用兔抗鴨疫里默氏桿菌1、2型陽性血清進(jìn)行鑒定，有凝集現(xiàn)象的為陽性，以無菌生理鹽水作對照。

1.2.6 PCR鑒定

引物設(shè)計與合成。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的所有16S rRNA的基因序列，找到RA 16S rRNA的高度保守區(qū)，設(shè)計一對特異性引物:上游引物為5′-GAGACACGGACCAGACTCCTACG-3′，下 游 引 物為 5′-ACCTCACGGCACGAGCTGACGACA-3′; 由 上海英駿生物公司合成，擴(kuò)增長度為749 bp。

PCR反應(yīng)體系及程序。以細(xì)菌的純培養(yǎng)物為模板，利用設(shè)計好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系 (25 μL):菌液 1 μL，上下游引物 (10 μmol)各 1 μL，2 × Mix 12.5 μL，H2O 9.5 μL。

PCR程序:94℃ 4 min;進(jìn)入循環(huán)94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次;72℃ 7 min;4℃保存。

PCR產(chǎn)物鑒定。電泳鑒定:將 PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳 (含GoldView)，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察是否出現(xiàn)目的條帶，并拍照記錄。

測序鑒定:將PCR產(chǎn)物回收純化后送上海英駿生物公司測序鑒定。

1.2.7 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間優(yōu)化

將鑒定為陽性的細(xì)菌劃線接種于血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)36 h，挑取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，振蕩 (100 r·min－1，下同)培養(yǎng)24 h，分別吸取5 mL菌液接種于4個裝有250 mL TSB培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，在A、B、C、D 4種條件下培養(yǎng):A為培養(yǎng)基中加2%初生牛血清，37℃振蕩培養(yǎng)，B為培養(yǎng)基中加2%初生牛血清，37℃靜置培養(yǎng)，C為37℃振蕩培養(yǎng)，D為37℃靜置培養(yǎng)。

培養(yǎng)每隔一段時間后，無菌條件下分別取少許菌液測D600值。記錄數(shù)據(jù)結(jié)果，并以時間為橫坐標(biāo)，D600為縱坐標(biāo)，制作D600-T曲線。

1.2.8 動物回歸試驗

將鑒定為陽性并經(jīng)分離純化的細(xì)菌，接種于TSB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)24 h。用生理鹽水洗滌菌體，并稀釋至D600約為0.5。

將購自養(yǎng)殖場的10日齡健康雛鴨飼養(yǎng)2日使其適應(yīng)環(huán)境，然后隨機分組:對照組2只和試驗組4只，分別稱重。試驗組頸部皮下注射接種0.5 mL菌液，對照組以同樣方法注射0.5 mL無菌生理鹽水。試驗組與對照組分開飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)、觀察1周，記錄鴨子的食用飼料重量、臨床表現(xiàn)等情況;對病死鴨進(jìn)行病理剖檢觀察，記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

共分離到2株細(xì)菌:A和B，在麥康凱平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板上不生長，在血瓊脂平板和TSA平板上可見露珠樣小菌落。

2.2 菌落形態(tài)觀察

血瓊脂平板和TSA平板上菌落大小及形態(tài)無明顯差異，2株細(xì)菌的菌落均呈露珠狀，圓形隆起，表面光滑，邊緣整齊，直徑為1～2 mm，顏色為灰白色，較透明;與RA菌落的形狀相似，疑似為RA。

2.3 染色鏡檢

革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰 (－)性小桿菌，少數(shù)呈橢圓形;瑞士染色后，鏡檢可見小桿狀細(xì)菌菌體呈兩極濃染，多為單個分散排列，少數(shù)成雙或短鏈排列。

2.4 生理生化試驗

生理生化試驗結(jié)果見表1。

表1 生理生化試驗結(jié)果

生理生化試驗結(jié)果與RA相符合，因此，初步認(rèn)定2株細(xì)菌均為鴨疫里默氏桿菌，但仍有待進(jìn)一步確認(rèn)。

2.5 血清學(xué)鑒定

玻片凝集試驗結(jié)果見表2。

表2 玻片凝集試驗結(jié)果

由凝集試驗結(jié)果可以確定，A、B 2株細(xì)菌均為鴨疫里默氏桿菌，且血清型相同，均為1型。

2.6 PCR鑒定

2.6.1 電泳鑒定

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

由圖1可見，1、2型鴨疫里默氏桿菌均能擴(kuò)增出目標(biāo)片段，大小與預(yù)期一致。

2.6.2 測序鑒定

2株細(xì)菌的序列完全相同，且與所選基因片段序列一致性為100%。因此，可確認(rèn)這2株細(xì)菌為鴨疫里默氏桿菌。

2.6.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹

通過 NCBI網(wǎng)站的 BLAST程序搜索與該16S rRNA基因序列相似度較高的其它菌株的序列，通過ClustalX和Mega程序，將PCR產(chǎn)物序列與其它7株細(xì)菌 (RA strain RAf103、Riemerellasp.IPDH 359/90、Uncultured bacterium clone nbw546c05c1、Flavobacteriumsp. 130704W2、 UnculturedCryomorphaceaebacterium clone XZXXH203、Anaerophaga thermohalophilastrain Fru22、Pasteuria goettingianae)的相似序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，如圖2。

圖2 1型RA與其它7株細(xì)菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹

由圖2可以推斷，試驗室所分離到的細(xì)菌與RA strain RAf103相同，與 Riemerella sp.IPDH 359/90同屬，與Flavobacterium sp.130704W2同為黃桿菌科，因此可以判定該株細(xì)菌為RA。綜上所述，該株細(xì)菌為1型鴨疫里默氏桿菌。

2.7 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間優(yōu)化

RA為兼性厭氧菌，其對培養(yǎng)條件的要求較為苛刻，生長速度較慢，不易被分離到，因此需選擇合適的培養(yǎng)條件和時間［9］。為了更加了解RA的生長特性，獲得較佳的培養(yǎng)條件和時間，本試驗對RA的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間進(jìn)行了研究和分析，結(jié)果見圖3。

圖3 RA菌在4種培養(yǎng)條件下的生長情況

由圖3中數(shù)據(jù)可見，A(37℃振蕩，加2%初生牛血清)、B(37℃靜置，加2%初生牛血清)、C(37℃振蕩)、D(37℃靜置)4種培養(yǎng)條件下，RA的生長情況為A條件下速度最快，C條件下其次，B和D條件下的速度較慢;且振蕩培養(yǎng)比向培養(yǎng)基中加入2%初生牛血清對RA生長的促進(jìn)作用更加明顯，因此，在培養(yǎng)RA時，應(yīng)盡可能振蕩培養(yǎng)。

從圖3可以看出，在A和C(均37℃振蕩培養(yǎng))2種培養(yǎng)條件下，RA的生長在28～32 h從對數(shù)期進(jìn)入穩(wěn)定期;而在B和D(均37℃靜置培養(yǎng))培養(yǎng)條件下，RA的生長沒有出現(xiàn)明顯地從對數(shù)期向穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)變。因此，RA在振蕩條件下培養(yǎng)28 h，即可完成培養(yǎng)，節(jié)省培養(yǎng)時間，若培養(yǎng)時間過長，RA進(jìn)入穩(wěn)定期，則會影響RA的生長。

2.8 動物回歸試驗

動物回歸試驗結(jié)果見表3。

在飼養(yǎng)過程中，對照組鴨長勢良好，育肥迅速，平均每日增重50 g，肉料較高，相對節(jié)約了飼料消耗，增加了養(yǎng)鴨場的經(jīng)濟(jì)效益，2只鴨均無患病臨床癥狀;剖解后未見任何病變，心臟、肝臟等器官均正常，且未分離到RA。

注:CK為注射生理鹽水;RA為注射1型RA;Δ體重為1周內(nèi)雛鴨體重變化;Δ飼料為1組雛鴨1周內(nèi)消耗飼料重量;肉料比為1周內(nèi)雛鴨體重變化與所消耗飼料的比值;死亡數(shù)為1周內(nèi)死亡鴨的數(shù)量。

試驗組鴨生長速度則大大降低，平均每日增重不到20 g，且肉料較低，使飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)效益降低;試驗組鴨均出現(xiàn)嚴(yán)重程度不同的鴨疫里默氏桿菌病的典型臨床癥狀:精神沉郁、萎頓，頭顫動，羽毛粗亂無光澤，食欲下降，肢體無力，行動困難，伏臥不起，排綠色稀糞等。剖解病死鴨發(fā)現(xiàn)各內(nèi)臟器官出現(xiàn)不同程度的病變，心臟明顯較小，心包膜增厚，腸系膜增多，將內(nèi)臟器官包住，肝臟較小，并見心包膜、腸系膜、肝臟外膜周圍出現(xiàn)灰白色纖維素性滲出物。從病死鴨心血、肝均分離到RA，經(jīng)玻片凝集和染色試驗，證明其血清型與攻毒菌相同。

3 小結(jié)

鴨疫里默氏桿菌可以使鴨、鵝、火雞等多種禽類患病，導(dǎo)致家禽育肥減慢或死亡，嚴(yán)重影響了養(yǎng)鴨業(yè)等的經(jīng)濟(jì)效益，給農(nóng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本次研究從養(yǎng)鴨場分離到2株細(xì)菌，通過傳統(tǒng)生理生化和分子生物學(xué)2種方法對其進(jìn)行了鑒定，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹，充分證明了這2株細(xì)菌為1型鴨疫里默氏桿菌。相對傳統(tǒng)方法，分子生物學(xué)方法具有快速、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點，本文建立的針對RA的16S rRNA基因PCR技術(shù)可用于快速檢測、鑒定鴨疫里默氏桿菌。

鴨疫里默氏桿菌對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求較高，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上不生長，為了更好地了解RA的生長特性，本次試驗對RA的生長條件和生長時間進(jìn)行了研究。試驗結(jié)果表明，RA在37℃振蕩培養(yǎng)能夠較好地生長，提高培養(yǎng)基的營養(yǎng)則能夠進(jìn)一步促進(jìn)RA的生長，但效果沒有振蕩培養(yǎng)的明顯，因此在分離和培養(yǎng) RA時，應(yīng)盡可能振蕩培養(yǎng)。

我們還進(jìn)行了動物回歸試驗。RA的感染使雛鴨生長速度減慢1/2以上，發(fā)育不良，并使1只試驗組鴨病死，嚴(yán)重影響了養(yǎng)鴨業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。與這2株RA的來源養(yǎng)鴨場相比，試驗室動物回歸試驗的雛鴨病死率相對較低，分析原因可能是飼養(yǎng)環(huán)境的問題:在大多數(shù)情況下，動物患病并不是由僅僅一種病原的侵染，可能是由于多種病原同時侵染或者病原侵染時動物的飼養(yǎng)環(huán)境較差，如低溫陰雨、潮濕、寒冷等惡劣環(huán)境的刺激，使得動物發(fā)病嚴(yán)重，造成病死率很高;而試驗室的飼養(yǎng)條件相對較好，從而導(dǎo)致動物回歸試驗的病死率并不高。所以，加強飼養(yǎng)管理，減少不良環(huán)境因素造成的應(yīng)激反應(yīng)，乃是動物生產(chǎn)的基本策略。

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