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    桃果實酰基輔酶A氧化酶活性檢測方法的建立

    2010-09-12 01:16:36劉巍立賈惠娟
    浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010年5期
    關(guān)鍵詞:酰基輔酶底物

    劉巍立,賈惠娟,張 鑫

    (浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 園藝系,浙江 杭州 310029)

    ?;o酶A氧化酶 (ACOX),亦稱脂酰基輔酶 A氧化酶。1969年,由 Cooper等[1]在蓖麻子胚乳中首次發(fā)現(xiàn),然后陸續(xù)在大鼠肝臟[2]、四膜蟲[3]、酵母菌[4]以及黃瓜苗子葉組織[5]、南瓜子葉組織[6]、西紅柿[7]上報道。

    ACOX屬氧化還原酶,專一作用于CH—CH基團(tuán),同時以O(shè)2作為受體,參與各類脂酸β-氧化的第一步反應(yīng)[8],也是酵母菌中 γ-癸內(nèi)酯合成的關(guān)鍵酶[9-10]。自發(fā)現(xiàn)以來,有多種活性測定方法問世。目前,植物中ACOX活性測定多采用Tris-HCl緩沖液萃取法[5-7,11],大鼠肝臟和酵母菌中采用磷酸鉀緩沖液 (KPB)萃取法[2,4],反應(yīng)體系最適pH 和溫度 隨 組 織 不 同 而 不 同[2,5-7,9,11], 但 有 關(guān) 果實組織中的活性測定方法尚未見報道。

    水蜜桃的香氣物質(zhì)是衡量桃果實品質(zhì)的重要指標(biāo)。成熟桃果實特征香氣物質(zhì)主要是“果香型”物質(zhì) γ-、δ-內(nèi)酯類[12-17],約占成熟果實總香氣的97% 左右[15,18],主要由 β-氧化途徑合成而來[12,19],ACOX是β-氧化降解代謝的限速酶[8]。因此篩選果實組織中的ACOX活性測定體系是研究果實香氣合成過程中ACOX功能的基礎(chǔ)。本文以湖景蜜露水蜜桃果實為材料,測定了pH 6.5~8.5,溫度20~40℃范圍內(nèi)果肉部分ACOX的活性變化,結(jié)合不同的萃取方法,建立果實組織中ACOX活性的穩(wěn)定檢測體系。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    湖景蜜露 (Prunus persicaL.)水蜜桃果實試材采自浙江嘉興鳳橋的經(jīng)濟(jì)果園,樹齡7年,常規(guī)田間管理,實驗取樣時果實的成熟度為生理成熟期[20],采摘后立即運(yùn)至實驗室,選擇大小均勻、無機(jī)械損傷的新鮮果實,置于恒溫箱中,20℃貯藏3 d,果實達(dá)到完熟,取果肉保存至-75℃。

    1.2 儀器及試劑

    測活所用棕櫚酰輔酶A、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及辣根過氧化物酶 (HRP)均為Sigma產(chǎn)品,安替比林與苯酚為國產(chǎn)試劑,其它化學(xué)試劑均為分析純。主要儀器有德國 Eppendorf centrifuge 5810R離心機(jī)、美國 Beckman UV800紫外/可見分光光度計和T25 basic ULTRA-TURRAX攪拌儀。

    1.3 酶活性測定方法

    以Allain等[21]方法為基礎(chǔ)加以改進(jìn),簡化操作步驟,縮減反應(yīng)體積。

    1.4 酶活性測定原理

    ACOX催化?;o酶A在β位氧化,形成烯并釋放過氧化氫。隨后在顯色反應(yīng)中,過氧化氫與安替比林、苯酚在過氧化物酶催化下,生成顯色產(chǎn)物醌亞胺。測定A500可計算ACOX催化反應(yīng)中過氧化氫的生成量。

    1.5 酶活性檢測體系

    1.5.1 酶粗液的萃取方法

    據(jù)文獻(xiàn)報道,ACOX有2種萃取方法 (表1),即使用Tris-HCl緩沖液和磷酸鉀緩沖液 (KPB)2種緩沖液。本實驗使用該2種緩沖液進(jìn)行酶活性檢測條件探索。

    方法1為磷酸鉀緩沖液萃取法 (KPB萃取法)。取5 g果肉組織,液氮研磨成粉末狀,加入不同梯度pH的磷酸鉀緩沖液8 mL,充分混勻,4℃,10 000g,離心5 min,取上清液,用于 ACOX酶活性測定。

    表1 ACOX的萃取方法

    方法 2為 Tris-HCl緩沖液萃取法 (Tris-HCl萃取法)。整個實驗在4℃環(huán)境中進(jìn)行。取5 g果肉組織,加入液氮研磨,加入25 mL丙酮(-20℃)充分混勻,12 000g離心30 min,去除上清液,沉淀加入 25 mL Tris緩沖液[150 mmol Tris-HCl(不同梯度 pH),10 mmol KCl,1 mmol EDTA,25%(m/V)蔗糖]溶解,然后高速攪拌使其混合均勻,用紗布過濾去除雜質(zhì),濾液經(jīng)12 000g離心30 min,取上清液水浴50℃加熱5 min,冰浴冷卻至2℃,12 000g離心30 min,取上清液用于 ACOX酶活性測定。

    1.5.2 pH對酶活性測定的影響

    配置pH值為6.5~8.5(梯度為0.5)磷酸鉀緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液,比較兩種萃取法不同pH對酶活性測定的影響,確定最適pH。

    1.5.3 溫度對酶活性的影響

    采用1.5.2中最適 pH,測定溫度20~40℃(梯度為5℃)下的酶活性,確定最適溫度。

    1.5.4 反應(yīng)體系

    70 μL反應(yīng)體系中含有 1 μL底物液-棕櫚酰輔酶 A(0.1 mmol·L-1),1 μL 苯 酚 溶 液 (1.06 mol·L-1),34 μL 顯色液 (60 U·mL-1辣根過氧化 物 酶,1.64 mmol·L-1安 替 比 林,20 μ mol·L-1FAD),34 μL 提取的粗酶液。1 μL 底物液,1 μL苯酚溶液,34 μL顯色液加入比色杯,20~40℃ (梯度為5℃)恒溫5 min,加入34 μL粗酶液,每隔15 s記錄1次D值變化,共測定5 min,以1~2 minD值變化計算酶活性。酶活性以ΔD500·g-1·min-1表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pH對酶活性測定的影響

    圖1為不同pH條件下,2種萃取方法粗酶液測定的吸光度值變化,隨著時間的變化,吸光度逐漸升高,2 min左右達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。圖2為不同pH條件下,不同萃取方法ACOX活性變化,2種萃取方法都在pH值7.5時,酶活性達(dá)到最大,分別為0.126 和 0.168 ΔD500·g-1·min-1,pH 偏高或偏低酶活性都有明顯下降。由此表明緩沖液pH對ACOX活性的測定結(jié)果有顯著影響。

    圖1 不同萃取方法粗酶液測定的吸光度值變化

    2.2 溫度對酶活性測定的影響

    圖3顯示,Tris-HCl 萃取法中,ACOX活性在30℃時達(dá)到最大,溫度過高過低,活性都會下降;KPB萃取法中,最適溫度為25℃,但25~35℃范圍內(nèi)活性變化不大。

    2.3 萃取方法對酶活性測定的影響

    盡管緩沖液的濃度和pH值相同,但緩沖液的類型對ACOX活性測定結(jié)果也會有明顯影響。如表2所示,2種萃取方法的酶活性測定結(jié)果有顯著差異。Tris-HCl萃取法測得的ACOX活性顯著高于KPB萃取法,標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)均小于KPB萃取法,說明Tris-HCl萃取法能更有效地提取桃果實中的ACOX,并且實驗誤差小,精度高。

    圖2 pH對桃果實中ACOX活性測定的影響

    圖3 溫度對桃果實中ACOX活性測定的影響

    表2 不同萃取方法的ACOX活性

    3 討論

    影響酶活性測定結(jié)果的因素主要有緩沖液、pH和溫度。酶學(xué)反應(yīng)中,反應(yīng)體系的pH值對酶生物催化活性至關(guān)重要。強(qiáng)酸或強(qiáng)堿都會影響酶的構(gòu)象,或改變酶與底物分子的結(jié)合、分離動態(tài),或使酶變形甚至失活,從而影響酶的活力[22]。研究表明,不同植物、不同組織中的ACOX活性測定的最適pH值不盡相同。黃瓜苗子葉組織活性測定的最適 pH 為 7.5[5],南瓜子葉組織為 7.8[6],西紅柿為 8.0[7],火炬松雌配子體為 7.5[11],酵母菌和大鼠肝臟組織分別為 7.5[4]和 7.4[2]。本實驗測得最適pH為7.5。

    溫度升高能加快酶反應(yīng)速度,但溫度過高也會破壞酶穩(wěn)定構(gòu)型,疏水殘基如色氨酸、苯丙氨酸等外露而失去催化活性[23]。本實驗發(fā)現(xiàn),采用30℃溫度測定,體系穩(wěn)定,精確度高。這與文獻(xiàn)中微生物和高等植物?;o酶A氧化酶最適測定溫度大多為30℃相一致。

    另一方面,萃取的緩沖液不同,所攜帶的無機(jī)離子不同,也可能最終影響萃取的結(jié)果和活性的測定。研究報道酵母菌中ACOX萃取多采用KPB萃取法,因其組織結(jié)構(gòu)簡單,通過磷酸鹽緩沖液粗提即可獲得較高的酶活性,而桃實結(jié)構(gòu)復(fù)雜,含有糖類、酚類等雜質(zhì)物質(zhì),對ACOX萃取產(chǎn)生了很大的影響。由于Tris-HCl萃取法經(jīng)過了粗提取、熱處理和沉淀處理,使酶活性顯著提高,而且反應(yīng)迅速穩(wěn)定。這與文獻(xiàn)中植物組織中 ACOX多采用Tris-HCl萃取法結(jié)論一致。

    4 小結(jié)

    本實驗在文獻(xiàn)報道方法的基礎(chǔ)上,確立了一個適合桃果實ACOX活性檢測的體系:整個實驗在4℃環(huán)境中進(jìn)行。取5 g果肉組織,加入液氮研磨,再加入25 mL丙酮 (-20℃)充分混勻,12 000g離心30 min,去除上清液,沉淀加入25 mL Tris緩沖液 (pH 7.5)[150 mmol Tris-HCl,10 mmol KCl,1 mmol EDTA,25%(m/V)蔗糖]溶解,然后高速攪拌使其混合均勻,紗布過濾去除雜質(zhì),濾液經(jīng)12 000g離心30 min,取上清液水浴50℃加熱5 min,冰浴冷卻至2℃,12 000g離心30 min,上清液用于ACOX活性的測定。70 μL反應(yīng)體系中含有1 μL底物液-棕櫚酰輔酶 A,1 μL苯酚溶液(1.06 mol·L-1),34 μL 顯色液 (60 U·mL-1辣根過氧化物酶,1.64 mmol·L-1安替比林,20 μmol·L-1FAD),34 μL 提取的粗酶液。1 μL 底物液,1 μL苯酚溶液,34 μL顯色液加入比色杯,30℃恒溫5 min,加入34 μL粗酶液,每隔15 s記錄1次D值變化,共測定5 min,以1~2 minD值變化計算酶活性,酶活性以 ΔD500·g-1·min-1表示。

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