不同基因型煙草品種接種赤星病菌后抗病蛋白的變化研究

曹祥煉，宋彥君，程海峰，豆顯武，楊鐵釗

(1.湖北省襄樊市煙草公司 ?？禑熑~分公司，湖北 ?？?441600;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002)

煙草赤星病是由鏈格孢菌［Ternaria alternata(Fries)Keissler］引致的煙葉成熟后期重要的葉部真菌性病害，嚴(yán)重影響著煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著煙草生產(chǎn)的發(fā)展。赤星病在世界各煙草產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一。赤星病具有潛育期短、流行速度快的特點，在環(huán)境條件有利于發(fā)病的情況下，短時間內(nèi)即可造成大的流行，給煙葉生產(chǎn)帶來巨大損失［1］。煙草赤星病1892年首次在美國發(fā)現(xiàn)，曾幾次給世界煙葉生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失［2］。1916年我國在北京附近首次發(fā)現(xiàn)，1964年在山東煙區(qū)流行，隨后全國各煙區(qū)有日益嚴(yán)重的趨勢。1989至1991年3年間，河南省平均每年因赤星病造成的損失達人民幣2 300萬元［3］，成為毀滅性的病害。2000年8月初在美國的康乃狄克州和麻薩諸塞州，煙草赤星病大爆發(fā)，分別減產(chǎn)至少達75% 和89%［4］。

植物受到病原真菌侵染時，會產(chǎn)生一系列的主動防御反應(yīng)。這些反應(yīng)包括:合成植保素，感染區(qū)域細(xì)胞結(jié)構(gòu)的加厚與增強，病程相關(guān)蛋白 (PR蛋白)的誘導(dǎo)和積累。這些反應(yīng)還參與了防衛(wèi)反應(yīng)中的信號傳遞，使植物獲得系統(tǒng)性抗性［5－6］。

病程相關(guān)蛋白中研究較多的是幾丁質(zhì)酶(Glu)和β-1，3-葡聚糖酶 (Cht)。很多植物病原真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)和葡聚糖，體外抑菌試驗表明，它們能抑制一些病原真菌孢子的萌發(fā)和病菌生長，因此幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶一直被看作是植物抗真菌病害的潛在物質(zhì)［5］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與種植

供試煙草品種為感赤星病品種長脖黃和高抗赤星病突變體凈葉黃，豫煙4號作感病對照，煙草品種來自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

試驗地點設(shè)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)。種子、植煙土壤經(jīng)過嚴(yán)格消毒，采用盆栽種植。3個品種分別于2008年5月10號移栽，重復(fù)3次，隨機區(qū)組排列，正常管理。

1.2 菌種與培養(yǎng)

孢子懸浮液。

1.3 接種與取樣

從煙草苗下部起選第3到第4片成熟葉片，噴霧接種，每個小區(qū)的各品種處理一致。接種后人工保溫30℃并保濕培養(yǎng)，分別于接種前0 h，接種后12，24，36和48 h取樣。以同生育期同部位成熟葉片噴施清水做空白對照。

田間采集到的赤星病菌強毒株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用無菌水洗下，配制成孢子濃度為106個·mL－1的孢子懸浮液。

1.4 測定方法

幾丁質(zhì)酶活性的測定參照 Boller等［7］的方法。β-1，3-葡聚糖酶活性的測定參照史益敏［8］的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶活性

幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁、昆蟲體壁和甲殼類動物中的主要結(jié)構(gòu)成分，但在高等植物中尚未發(fā)現(xiàn)有幾丁質(zhì)的存在。當(dāng)植物受到病原物侵染時體內(nèi)會積累病程相關(guān)蛋白 (pathogenesis-relatedprotein，PR)，已證明部分PR是幾丁質(zhì)酶［10］。很多研究表明，幾丁質(zhì)酶在參與寄主植物和病原菌之間相互作用有2個方面，即幾丁質(zhì)酶有潛在的抗菌特性的直接作用和通過釋放幾丁質(zhì)寡聚物而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的間接作用［11］?，F(xiàn)已有大量的試驗證實，植物幾丁質(zhì)酶是可以被誘導(dǎo)的，大多數(shù)高等植物體內(nèi)所含的幾丁質(zhì)基因表達水平很低或不表達，而在受到如病原菌侵染、外源幾丁質(zhì)、殼聚糖、水楊酸和乙烯等因子作用時均能被誘導(dǎo)表達［12］。

測定不同基因型的煙草品種接種赤星病菌后在正常生長條件下其葉片內(nèi)幾丁質(zhì)酶的基礎(chǔ)活性，結(jié)果如圖1所示:抗病品種凈葉黃幾丁質(zhì)酶總活性的平均值為7個活力單位 (U)，感病品種長脖黃為3個活力單位，而另一感病品種豫煙4號的幾丁質(zhì)酶的基礎(chǔ)活性為4個活力單位左右。由此可見在正常生長條件下，抗病品種凈葉黃比感病品種長脖黃和豫煙4號體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基礎(chǔ)活性高。

圖1 抗性煙草品種未接種幾丁質(zhì)酶的變化

從圖2－4可以看出，無論是抗病品種還是感病品種，接種赤星病菌后幾丁質(zhì)酶含量與其基礎(chǔ)含量相比都呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。3個品種在接種赤星病菌后的前12 h幾丁質(zhì)酶活性均上升較慢，凈葉黃在接種后12～24 h幾丁質(zhì)酶含量達到10.06個活力單位，此后幾丁質(zhì)酶活性仍一直上升，但升高速度減慢。感病品種長脖黃和豫煙4號幾丁質(zhì)酶活性變化規(guī)律基本一致，在接種赤星病菌后48 h內(nèi)酶活性呈上升趨勢。幾丁質(zhì)酶潛在的抗菌特性的直接作用導(dǎo)致酶活性在接種前期劇烈上升，之后通過釋放幾丁質(zhì)寡聚物而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的間接作用，從而導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶活性的在接菌后的48 h內(nèi)一直上升。從圖5可以看出，不同抗性煙草品種在接種赤星病菌后的前12 h，抗病品種凈葉黃幾丁質(zhì)酶活性上升速度比感病品種長脖黃和豫煙4號要快，且在整個過程中凈葉黃的幾丁質(zhì)酶活性都比長脖黃和豫煙4號要高，這可能是凈葉黃抗赤星病的原因。

圖2 凈葉黃接種后幾丁質(zhì)酶的變化

圖3 長脖黃接種后幾丁質(zhì)酶的變化

圖4 豫煙4號接種后幾丁質(zhì)酶的變化

圖5 抗性煙草品種接種后幾丁質(zhì)酶的變化

2.2 β-1，3-葡聚糖酶活性

測定不同基因型的煙草品種接種赤星病菌后，在正常生長條件下其葉片內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶的基礎(chǔ)活性，結(jié)果如圖6所示:不同基因型煙草品種β-1，3-葡聚糖酶活性變化與幾丁質(zhì)酶基礎(chǔ)活性變化基本一致，都表現(xiàn)為長脖黃酶基礎(chǔ)活性最低，凈葉黃基礎(chǔ)活性最高，豫煙4號居中?？共∑贩N凈葉黃在正常生長條件其β-1，3-葡聚糖酶基礎(chǔ)活性的平均值為1 950個活力單位，感病品種長脖黃基礎(chǔ)活性為1 700個活力單位，而另一感病品種豫煙4號為1 850個活力單位上下。由此可見在正常生長條件下，抗性品種凈葉黃比感病品種長脖黃體和豫煙4號體內(nèi)幾丁質(zhì)酶的活性高。

圖6 抗性煙草品種β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

測定不同品種在接種赤星病菌后β-1，3-葡聚糖酶酶活性的變化，結(jié)果如圖7－9所示，無論是抗病品種還是感病品種，接種赤星病菌后β-1，3-葡聚糖酶含量與其基礎(chǔ)含量相比都呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。凈葉黃在接菌后12 h內(nèi) β-1，3-葡聚糖酶達到2 272.4個活力單位，此后 β-1，3-葡聚糖酶活性仍一直上升，但升高速度減慢。這可能與葡聚糖在細(xì)胞壁內(nèi)部外部均存在有關(guān)。感病品種長脖黃和豫煙4號β-1，3-葡聚糖酶活性變化規(guī)律基本一致，在接種赤星病菌48 h內(nèi)酶活性呈上升趨勢。從圖10可以看出，不同抗性煙草品種在接種赤星病菌后的前12 h，抗病品種凈葉黃β-1，3-葡聚糖酶活性上升速度比感病品種長脖黃和豫煙4號要快，而感病品種長脖黃和豫煙4號在接種后12～24 h β-1，3-葡聚糖酶酶活性上升較快，但比抗病品種晚12 h。在整個過程中凈葉黃的β-1，3-葡聚糖酶活性都比長脖黃和豫煙4號要高，這可能是凈葉黃抗赤星病的原因。

圖7 凈葉黃接種后β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

圖8 長脖黃接種β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

圖9 豫煙4號接種β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

圖10 不同抗性品種β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

2.3 幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性變化趨勢

從圖11可以看出，凈葉黃在接菌后 β-1，3-葡聚糖酶變化比較平穩(wěn)，幾丁質(zhì)酶在接菌后12 h劇烈上升，24～48 h緩慢上升;感病品種長脖黃在接菌后，β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性變化趨勢基本一致，在整個過程中一直呈上升趨勢，幾丁質(zhì)酶在24～36 h劇烈上升，在36 h上升緩慢 (圖12);豫煙4號 β-1，3-葡聚糖酶活性在12～36 h上升明顯，幾丁質(zhì)酶酶活性在24～36 h明顯增強(圖13)。從時間上看感病品種長脖黃和豫煙4號幾丁質(zhì)酶酶活性劇烈上升比抗病品種凈葉黃晚12 h。3個品種在接菌后幾丁質(zhì)酶和 β-1，3-葡聚糖酶酶活性均表現(xiàn)一定的相似性，幾丁質(zhì)酶酶活性劇烈上升時間比β-1，3-葡聚糖酶晚。分析認(rèn)為，可能與β-1，3-葡聚糖在病菌細(xì)胞壁內(nèi)部外部都存在，而幾丁質(zhì)主要存在與病菌的細(xì)胞壁內(nèi)部有關(guān)。

圖11 凈葉黃接種后幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶酶活性的變化

圖12 長脖黃接種后幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶酶活性的變化

圖13 豫煙4號接種后幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶酶活性的變化

3 小結(jié)與討論

幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)成分 ，在許多真菌的菌絲頂端 ，β-1，3-葡聚糖和幾丁質(zhì)暴露在細(xì)胞壁表面 ，能夠直接受到β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的水解［14］，這不僅使真菌菌絲生長點受到破壞 ，而且在水解過程中由真菌細(xì)胞壁釋放出來的寡糖能夠作為植物多種抗病反應(yīng)的激發(fā)因子 ，誘導(dǎo)植物的全面防衛(wèi)反應(yīng)［14］。在正常生長條件下，抗病品種凈葉黃比感病品種長脖黃和豫煙4號體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基礎(chǔ)活性高，接種赤星病菌后抗病品種凈葉黃幾丁質(zhì)酶活性上升速度比感病品種長脖黃和豫煙4號要快。凈葉黃在接種后12 h幾丁質(zhì)酶活性迅速升高，在之后的24 h幾丁質(zhì)酶活性又一次劇烈上升?？赡苡捎趦羧~黃在赤星病菌接種初期，直接攻擊病原物真菌的細(xì)胞壁，使病原菌瓦解失去致病力，同時酶解后病原菌的細(xì)胞壁破碎物又可作為激發(fā)子再次刺激植物產(chǎn)生抗病防衛(wèi)反應(yīng)，導(dǎo)致酶活性又一次升高，從而達到抗病的目的。

在接種后的整個反應(yīng)過程中長脖黃和豫煙4號的幾丁質(zhì)酶活性與其對照相比都有不明顯的提高，但比凈葉黃的要低得多。分析認(rèn)為赤星病菌侵染感病品種長脖黃和豫煙4號后，由于煙草體內(nèi)被誘導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶的活性很低，抵抗和殺死病菌的能力差，是導(dǎo)致感病品種發(fā)病的原因之一。

無論是抗病品種還是感病品種，接種赤星病菌后β-1，3-葡聚糖酶含量與其基礎(chǔ)含量比都有明顯的上升。推斷由于接種后，隨著赤星病菌的入侵，煙草啟動體內(nèi)有關(guān)的抗病防衛(wèi)機制，相關(guān)抗病蛋白酶被激活。由于β-1，3-葡聚糖酶直接作用于赤星病菌的細(xì)胞壁，因此酶活性的升高對赤星病菌起到抑制作用。凈葉黃的β-1，3-葡聚糖酶的積累不管是在量上還是在時間上都比長脖黃和豫煙4號要快，對于病原菌的入侵凈葉黃反應(yīng)較迅速，能及時抑制病原菌，阻止病害進一步擴展。從實驗結(jié)果可以看出，3個品種幾丁質(zhì)酶積累時間與β-1，3-葡聚糖酶積累時間相比具有一定滯后性，可能與葡聚糖在真菌細(xì)胞壁內(nèi)外都有，而幾丁質(zhì)主要存在于細(xì)胞壁內(nèi)部有關(guān)。

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