全基因組芯片篩查非小細胞肺癌組織多藥耐藥相關基因

劉美燕 李春紅 閆安 蔡莉

肺癌是目前世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一，與20世紀初相比，現(xiàn)在肺癌已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的最大敵人之一，其5年生存率僅為15%左右[1]。70%-80%的肺癌患者在確診時已屬晚期，化療是最主要的治療手段之一。腫瘤細胞對抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性是導致化療失敗的主要原因。肺癌耐藥與多種基因的表達異常相關，全面揭示化療耐藥的分子學變化特征，并篩選出與藥物敏感性密切相關的基因群即化療藥敏預報基因，對于準確評估患者的化療敏感性，進而指導臨床治療具有重要意義。

迅速發(fā)展的基因芯片技術能從群體水平對非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的耐藥相關基因進行研究。本研究收集臨床手術切除的NSCLC組織進行原代培養(yǎng)和藥物敏感性測定，篩選出對5種化療藥物（諾維本、吉西他濱、多西他賽、紫杉醇及順鉑）耐藥或敏感的組織，以cDNA芯片分析基因表達譜的變化，篩查耐藥相關的基因，為尋找化療藥敏預報基因提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 黑龍江省腫瘤醫(yī)院手術室2007年11月-2009年8月的病理分型確定且術前、術中未行放、化療的NSCLC組織75例，于取樣1 h內(nèi)進行試驗。

1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），MTT粉（AMRESCO公司），RPMI-1640培養(yǎng)液（GIBCO公司），酶標儀（美國BioTeK公司）。人類全基因組表達譜寡聚核苷酸芯片Human Genome U133 2.0 plus Affymetrix購自美國公司，該芯片含47 400個轉錄本，共代表38 500個基因?；蛐酒饕噭┌ǎ篍ukaryotic Poly-A RNA Control Kit、One-Cycle cDNA Synthesis Kit、GeneChip IVT Labeling Kit、GeneChip Sample Cleanup Module均為Affymet rix公司產(chǎn)品。

1.3 人NSCLC細胞的原代培養(yǎng) 超凈臺內(nèi)去除腫瘤組織血管、結締組織和壞死組織，PBS將腫瘤組織清洗至透明后，移至含有0.25%濃度胰蛋白酶液的平皿中，邊消化邊剪，盡量將腫瘤組織剪碎至糊狀，再用玻璃注射器芯經(jīng)200目的不銹鋼網(wǎng)篩輕輕研磨，邊研磨邊滴加RPMI-1640培養(yǎng)液邊過濾。將得到的細胞液經(jīng)腫瘤細胞分離液離心（1 000 rpm, 5 min），小心地吸取中層的絮狀物質，即腫瘤細胞，將收集得到的腫瘤細胞用1640培養(yǎng)液混勻制成腫瘤細胞懸液，用計數(shù)板細胞計數(shù)，調整活細胞數(shù)1×105/mL。取部分細胞加入Trizol吹打均勻，存放于-80oC冰箱中。

1.4 MTT法檢測5種化療藥對原代人NSCLC細胞的細胞毒作用 將各種肺癌細胞系懸液以1×105/mL接種于96孔微量培養(yǎng)板中，190 μL/孔，將96孔板放入37oC、5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入7種濃度的抗癌藥各10 μL（根據(jù)分別的臨床血漿高峰濃度配置成7種濃度：分別為10×ppc、5×ppc、2.5×ppc、1.25×ppc、0.625×ppc、0.312 5×ppc、0.156 25×ppc）（①NVB；②GEM；③DOC；④TAL；⑤CDDP），設4個復孔；同時設細胞對照孔，只加細胞培養(yǎng)液。將加藥后的96孔板放入37oC、5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL, PBS），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板，1 500 rpm離心5 min，吸棄上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩混勻，使甲臜（Formazan）顆粒完全溶解后，以560 nm波長測定光密度（optics density, OD）值，計算抑制率：

抑制率（%）=（對照孔OD值-實驗孔OD值）/（對照孔OD值）×100 %。

根據(jù)不同濃度梯度的抑制率擬合曲線，選擇劑量反應關系良好的標本，以血藥峰濃度下細胞抑制率≥50%為高度敏感、30%-50%為中度敏感、≤30%為耐藥作為區(qū)分標準，挑選對5種化療藥均高度敏感或耐藥的樣本進行基因芯片試驗，并將其分為高度敏感組和耐藥組。

1.5 標本總RNA提取 將1 mL Trizol分別加入收集好的高度敏感組和耐藥組細胞中，充分裂解后加入250 μL氯仿，離心后取上清液至一新的離心管中，加入500 μL異丙醇，室溫沉淀1 h，15 000 g/min離心10 min，此時可見少許白色RNA沉淀緊貼于管壁。棄上清，以1 mL 75 %乙醇洗滌，7 500 g/min離心5 min，將RNA溶解于20 μL DEPC水中，測定濃度和純度后-80oC保存。

1.6 基因芯片檢測基因表達譜 使用Eukaryotic Poly-A RNA Controls Kit制備合成用Poly-A RNA Controls，制備T7-Oligo(dT)Primer/Poly-A Control Mix。將1 μg RNA樣品與T7-Oligo(dT)Primer/Poly-A Control Mix混合，首先使用One-Cycle cDNA Synthesis Kit逆轉錄合成cDNA，然后進行二鏈DNA的合成和純化。體外轉錄合成生物素標記cRNA。取適量cRNA制備雜交液并與芯片進行雜交過夜。雜交完成后，移除探針陣列中的雜交混合物，利用Fluidics Station 450進行芯片清洗，最后利用Affymetrix GeneChip?Scanner 3000對芯片進行掃描。掃描圖像采用Affymetrix GeneChip?Operating Software Version 1.0軟件進行數(shù)字化處理和分析。

2 結果

2.1 NSCLC組織標本的收集及藥敏試驗結果 通過MTT方法挑選對5種化療藥均高度敏感或耐藥的樣本，并將其分為高度敏感組和耐藥組。共選出11例樣本，其中高度敏感組6例，耐藥組5例（表1）。

2.2 基因芯片對耐藥和高度敏感NSCLC組織細胞表達差異基因篩查結果 掃描圖像采用Affymetrix GeneChip?Operating Software Version 1.0軟件進行數(shù)字化處理和分析。差異探針篩選標準：|Score(d)|≥2，同時差異倍數(shù)即Fold Change控制在2倍以上，樣本數(shù)≥3。經(jīng)過軟件進行數(shù)字化處理和分析后發(fā)現(xiàn)，耐藥組與高度敏感組差異表達基因一共有212個，占總表達基因數(shù)的5.51‰，其中敏感組上調168個，下調44個（表2）。

GO分析結果顯示，NSCLC組織抗癌藥物敏感性相關差異表達的基因包括：具有結合功能蛋白的基因、酶活性相關基因、離子結合相關基因、離子通道及轉運蛋白相關基因、氧化還原活性相關基因、細胞骨架蛋白相關基因、應激反應相關基因、信號轉導通路相關基因、細胞生長及維持相關基因、細胞周期及調節(jié)相關基因、細胞運動及細胞間粘附相關基因、細胞凋亡及調節(jié)相關基因等。其中按分子功能分類的結果如（表3）。

3 討論

化療是治療NSCLC的主要方法之一。NSCLC手術切除后應用化療，可以殺傷殘留癌細胞，對防止腫瘤復發(fā)和轉移具有積極意義。對于失去手術機會的NSCLC患者，化療可以在一定程度上延緩腫瘤的生長，甚至有可能使腫瘤縮小、為患者爭取二期手術的機會。然而，化療藥物普遍存在的多藥耐藥現(xiàn)象限制了其獲得更好的療效和更廣泛的臨床應用[2]。為了更好地研究NSCLC多藥耐藥的發(fā)生機制，本研究通過基因芯片技術，利用Affymetrix GeneChip?Scanner 3000對芯片進行掃描，篩選可能與NSCLC多藥耐藥相關的基因，耐藥組與高度敏感組差異表達基因一共有212個，其中高度敏感組上調168個，下調44個。這212個差異表達基因中，曾被文獻報道過的與耐藥相關的基因并不多。

信號轉導通路參與了細胞的生長、增殖及凋亡的調控，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能。在NSCLC多藥耐藥的發(fā)生過程中涉及到較多的信號轉導通路的改變，包括JAK-STAT信號轉導通路、TGF-β信號轉導通路、p53信號通路等。其中，TGF-β信號通路可以調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、遷移等多種生物過程[3,4]。

SMAD1蛋白是TGF-β信號通路主要的細胞內(nèi)信號傳導分子，已有研究報道在腫瘤中存在SMAD1的異常表達，且SMAD1參與TGF-β信號通路的調節(jié)。Liu等[5]的研究發(fā)現(xiàn)在腦膠質瘤患者中，SMAD1基因表達的下調與患者生存期的降低顯著相關。本研究耐藥組中SMAD1基因的表達均下調，預示SMAD1基因可能與腫瘤耐藥性相關，可通過上調SMAD1基因的表達來增強NSCLC化療的敏感性，提高患者的生存期。

表1 化療藥對11例非小細胞肺癌標本細胞的抑制率（%）Tab 1 Inhibition rates of drugs on non-small cell lung cancer cells in 11 specimens (%)

表2 非小細胞肺癌組織抗癌藥物敏感性相關基因的表達狀態(tài)Tab 2 Numbers of differentially expressed genes out of 38 500 candidate genes and ratios of expression intensity in non-small cell lung cancer

表3 非小細胞肺癌細胞株抗癌藥物敏感性相關基因差異表達的分類Tab 3 Category of the differentially expressed genes related to anticancer drug-sensitivity in non-small cell lung cancer

Cathepsin是存在于細胞溶酶體內(nèi)的蛋白酶類，有B、H、L、D等亞類。Cathepsin可通過多種路徑引起細胞的凋亡[6]。Cathepsin B和Cathepsin L與惡性腫瘤的轉移和癌癥的進展密切相關[7-9]。Reisenauer[10]認為，Cathepsin B活性的增加可抑制細胞凋亡，并伴有TGF-β信號通路中SMAD1基因的表達下調。本試驗結果中敏感組SMAD1基因表達上調，同時Cathepsin B基因表達下調，而耐藥組Cathepsin B基因表達上調。所以通過抑制Cathepsin B基因的表達可能會降低腫瘤的耐藥性，提高化療的療效。

AZGP1（alpha-2-glycoprotein 1, zinc-binding）即鋅α2-糖蛋白（ZAG）中是40 kDa的單鏈多肽[11]。在Albertus[12]的研究中發(fā)現(xiàn)，40%肺腺癌患者的血清中檢測到AZGP1自身抗體，而自身抗體的產(chǎn)生與5年生存率的提高顯著相關。Henshall[13]的研究表明，AZGP1的低表達與前列腺癌的臨床復發(fā)、骨轉移和生存顯著相關，在17例短期內(nèi)即出現(xiàn)復發(fā)的前列腺癌的患者中，其中13例存在AZGP1基因表達減弱或缺失的現(xiàn)象。上述結論表明惡性腫瘤患者中AZGP1的降低提示預后不良，本研究結果顯示在敏感組細胞中的AZGP1呈高表達狀態(tài)，差異倍數(shù)達到31.2，而在耐藥組細胞中呈低表達狀態(tài)，提示AZGP1的低表達可能與耐藥機制相關，從而引起預后不良，但尚需進一步實驗研究證實。

NSCLC化療耐藥是一個多基因、多環(huán)節(jié)、多途徑參與的過程，可能涉及影響不同生化途徑的多種遺傳因子表達的改變。本研究利用全基因組芯片高靈敏度、高通量的特點，初步篩選出一系列可能與NSCLC多藥耐藥相關基因。并結合生物信息學找出可能與腫瘤藥物敏感性和耐藥性相關的基因，下一步將對差異基因做進一步的驗證，尋找出與腫瘤化療敏感性和耐藥性相關的分子標志物，構建NSCLC多藥耐藥基因相關的cDNA文庫。