脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染UCH-L1 siRNA 對肺腺癌細(xì)胞系H157細(xì)胞增殖和凋亡的影響

屈肖杰 王衍富

泛素羧基末端水解酶-1（ubiquitin C terminal hydrolase-L1, UCH-L1），又名蛋白基因產(chǎn)物（PGP9.5），是泛素-蛋白酶體系中的重要成員，在細(xì)胞的蛋白水解途徑中起調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和死亡的重要作用。UCH-L1為泛素水解酶，它廣泛表達(dá)于神經(jīng)元分化的各個(gè)階段，為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的一個(gè)特定組織標(biāo)志物。UCH-L1介導(dǎo)的針對細(xì)胞蛋白的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因的重要機(jī)制，通過引起細(xì)胞周期蛋白的去泛素化增加而促進(jìn)未分化的體細(xì)胞無序生長和繁殖，同時(shí)UCH-L1的表達(dá)可能誘導(dǎo)一些能影響細(xì)胞分裂周期的基因[1-6]。因此，UCH-L1在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)方面具有重要作用，從而與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要關(guān)系。

Hibi等[1]應(yīng)用SAGE法觀察到UCH-L1在原發(fā)性肺癌和肺癌細(xì)胞株中高表達(dá)，但是在正常肺組織中未檢測到。UCH-L1表達(dá)不僅與小細(xì)胞肺癌發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)，而且也與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后有密切關(guān)系。高表達(dá)者進(jìn)展快、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲潛力強(qiáng)及預(yù)后差，可見UCH-L1的表達(dá)是不依賴神經(jīng)分泌而獨(dú)立存在的與肺癌病理分期及預(yù)后相關(guān)的重要生物學(xué)指標(biāo)。為了探討靶向UCH-L1治療在肺癌發(fā)生發(fā)展中的意義和價(jià)值，評(píng)價(jià)siRNA介導(dǎo)的基因治療技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成特異性靶向治療UCH-L1的siRNA分子，并將其轉(zhuǎn)染至UCH-L1陽性表達(dá)肺癌細(xì)胞株H157細(xì)胞，觀察其對UCH-L1表達(dá)的阻抑作用及其對肺癌細(xì)胞凋亡、增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人肺腺癌H157細(xì)胞由大連醫(yī)科大學(xué)病理科惠贈(zèng)。UCH-L1 siRNA、UCH-L1及β-actin鼠抗人單克隆抗體購自Santa公司，脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）購自Invitrogen公司，IMDM培養(yǎng)液、胎牛血清購自GIBCO公司，UCH-L1上下游引物及RT-PCR相關(guān)試劑盒購自Takara公司。Trizol試劑、蛋白提取液、蛋白定量試劑盒及發(fā)光液ECL購自碧云天公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞株的培養(yǎng) 人肺腺癌H157細(xì)胞在含10%胎牛血清、青霉素（100 μg/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）的IMDM中培養(yǎng)，溫度為37oC，CO2濃度為5%。

1.3 UCH-L1 siRNA分子的設(shè)計(jì)與合成 UCH-L1 siRNA分子由Santa公司設(shè)計(jì)并合成，該序列經(jīng)BLAST查詢，確定為UCH-L1特異性序列，排除與其它基因同源。陰性對照為由Santa公司提供的亂序序列。

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的H157細(xì)胞，傳代接種于6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度，使每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。設(shè)置：①空白對照組；②陰性對照組：轉(zhuǎn)染陰性對照亂序siRNA序列；③siRNA轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染特異性siRNA序列；④方法：按Invitrogen公司提供的轉(zhuǎn)染試劑手冊操作。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 將收獲的各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的冰乙醇，4oC內(nèi)固定24 h后使用；將固定好的細(xì)胞，碘化丙啶溶液避光染色30 min后待用；采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，以488 nm氬離子激光激發(fā)，采用Expo 32 ADC軟件進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析。

1.6 RT-PCR術(shù)檢測UCH-L1 mRNA水平 收集培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/孔-1×107個(gè)/孔，采用Trizol法提取總RNA。采用10 μL反應(yīng)體系（含待測RNA 1 μL，AMV 0.5 μL及適當(dāng)濃度的Oligod T、dNTP和氯化鎂）30

oC反應(yīng)10 min，42oC反應(yīng)45 min，99oC反應(yīng)5 min，5oC反應(yīng)5 min以合成cDNA。PCR反應(yīng)體系采用40 μL反應(yīng)體系（5×PCR Buffer 10 μL，Taq酶0.25 μL，引物各0.5 μL），PCR反應(yīng)條件為94oC反應(yīng)2 min，49.5oC反應(yīng)45 s，72oC反應(yīng)2 min，共經(jīng)過35個(gè)循環(huán)反應(yīng)。所用的UCH-L1的引物序列：上游為5'-CCCGAGATGCTGAACAAA-3'；下游為5'- GCCACTGCGTG AATAAGT-3'；產(chǎn)物為272 bp。同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參照，其引物序列為：上游：5'-GTGGGGCGCCCC AGGCACCA-3'，下游：5'-CTCCTTAATGTCACGC ACGATTTC-3'；產(chǎn)物為540 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外線下觀察并應(yīng)用Labworks軟件分析計(jì)算各條帶的積分光密度（integrate optical density, IOD）以UCH-L1與β-actin的IOD比值表示UCH-L1 mRNA的相對含量。

1.7 Western blot法檢測UCH-L1蛋白水平 收集培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞蛋白提取液及PMSF（兩者比例是1 000:1）提取蛋白，將蛋白定量后，轉(zhuǎn)到PVDF膜，膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加UCH-L1和β-actin鼠抗人抗體4oC孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，將PVDF膜進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，暗室中洗片機(jī)洗片。Labworks軟件分析計(jì)算各條帶的IOD，以UCH-L1與β-actin的IOD比值表示UCH-L1蛋白的相對含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每組數(shù)據(jù)表示采用Mean±SD表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)的變化：轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞貼壁較好，呈扁平多角形，中間有圓形的核，核內(nèi)有一至多個(gè)核仁；轉(zhuǎn)染后48 h，細(xì)胞體積收縮，貼壁不佳，細(xì)胞突起消失（見圖1）。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞檢測細(xì)胞周期和凋亡，結(jié)果顯示，UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯被阻滯于G2/M期，三組的凋亡率分別為UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染組（28.06±1.58）%、空白對照組（0.45±0.09）%、陰性對照組（0.52±0.07）%，空白對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），siRNA轉(zhuǎn)染組與兩個(gè)對照組間比較差異均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。這說明UCH-L1 siRNA可以明顯抑制UCH- L1，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖2）。

2.3 UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染對H157細(xì)胞UCH-L1 mRNA的影響 通過RT-PCR可獲得272 bp（UCH-L1）和540 bp（β-actin）兩條帶，β-actin在各組中表達(dá)相似、條帶清晰，siRNA轉(zhuǎn)染組UCH-L1表達(dá)的條帶亮度低于其余各組，經(jīng)Labworks軟件分析系統(tǒng)鑒定電泳結(jié)果后，得出UCH-L1/β-actin吸光度比值：空白對照組分別為0.523±0.090；陰性對照組分別為0.520±0.108，這兩個(gè)對照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。siRNA轉(zhuǎn)染組比值分別為0.260±0.037，與兩個(gè)對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。結(jié)果表明，UCH-L1 siRNA作用于H157細(xì)胞48 h后UCH-L1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，而空白對照組、陰性對照組UCH-L1 mRNA水平無明顯變化。表明UCH-L1 siRNA可誘導(dǎo)UCH-L1 mRNA特異性降解（見圖3）。

圖1 熒光顯微鏡顯示轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Fig 1 Cell morphological changes observed with microscope

圖2 H157流式細(xì)胞術(shù)顯示H157細(xì)胞凋亡情況Fig 2 H157 cell apoptosis index detected by flow cytometry

2.4 UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染對H157細(xì)胞UCH-L1 蛋白水平的影響 通過Western blot可獲得25 kDa（UCH-L1）和43 kDa（β-actin）兩條帶，β-actin在各組中表達(dá)相似、條帶清晰，siRNA轉(zhuǎn)染組UCH-L1表達(dá)的條帶亮度低于其余各組，經(jīng)Labworks軟件分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果后，得出UCH-L1/β-actin吸光度比值：空白對照組0.739±0.053；陰性對照組0.661±0.065，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。siRNA轉(zhuǎn)染組比值為0.254±0.041，與兩個(gè)對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)果表明，UCH-L1 siRNA作用于H157細(xì)胞48 h后UCH-L1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而空白對照組、陰性對照組UCH-L1蛋白水平無明顯變化。表明UCH-L1 siRNA可誘導(dǎo)UCH-L1蛋白特異性降解（圖4）。

圖3 RT-PCR檢測H157細(xì)胞UCH-L1的表達(dá)Fig 3 Transcription expression of UCH-L1 gene in H157 cells detected by RT-PCR

圖4 Western blot檢測H157細(xì)胞UCH-L1的表達(dá)Fig 4 UCH-L1protein expression detected in H157cell lines by Western blot

3 討論

細(xì)胞凋亡對細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)生起著重要的作用，許多研究表明凋亡調(diào)節(jié)功能的異常與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其中多個(gè)癌基因、抑癌基因在細(xì)胞凋亡途徑中起作用。UCH-L1是由223個(gè)氨基酸組成的一類半胱氨酸水解酶，分子量約25 kDa。泛素-蛋白水解酶體途徑[7]（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)蛋白ATP依賴性的非溶酶體降解途徑，高效并高度選擇性地進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)換，還參與某些重要蛋白質(zhì)的編譯后修飾和改造。因此，對維持細(xì)胞正常生理功能具有十分重要的意義。UCH-L1通過泛素-蛋白水解酶體途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、分化與凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，從而與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有重要關(guān)系。

UCH-L1在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，Takase等[6]在40例切除的食管癌（鱗狀細(xì)胞癌）中發(fā)現(xiàn)19例（48%）有UCH-L1的表達(dá)。Otsuki等[8]表明UCH-L1在骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)，并表明UCH-L1可能是血液系統(tǒng)惡性腫瘤中骨髓瘤的一個(gè)很好的標(biāo)志物。Takano等[5]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測80例甲狀腺髓樣癌組織中UCH-L1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在11例遺傳性和散發(fā)性甲狀腺癌中出現(xiàn)UCH-L1 mRNA過度表達(dá)。Miyoshi等[9]通過研究乳腺癌組織中UCH-L1和UCH-L3的mRNA表達(dá)水平，表明在乳腺癌中UCH-L1和UCH-L3 mRNA高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。Tezel等[10]發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中UCH-L1的高度表達(dá)與術(shù)后生存期有著重要的反向關(guān)系。并表明UCH-L1可能成為胰腺癌患者手術(shù)預(yù)后的標(biāo)志物。最近，Tanaka等[11]發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移組織中UCH-L1的表達(dá)下調(diào)，提示UCH-L1的表達(dá)似乎與人類腎癌細(xì)胞SN12C的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。

UCH-L1在肺癌細(xì)胞中也有表達(dá)，Bittencourt等[12]表明在肺癌和肺癌細(xì)胞株中有UCH-L1的高表達(dá)。Sasaki等[13]應(yīng)用RT-PCR研究95例非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中UCH-L1的表達(dá)情況，結(jié)果表明有18例（12.8%）檢測到UCH-L1轉(zhuǎn)錄，而正常肺組織中僅有一些微弱表達(dá)。而且UCH-L1表達(dá)與年齡、性別、身體狀況或者病理類型無關(guān)，但是相對于T1/T2 NSCLC （6/54,11.1%），UCH-L1優(yōu)先表達(dá)于T3/T4 NSCLC（12/41,29.3%）。這說明UCH-L1可能與NSCLC的發(fā)展和侵襲有關(guān)。這些結(jié)果為癌癥的選擇性治療提供了一個(gè)新的途徑。

RNA干擾[14]（RNA interference, RNAi）是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，可高效、特異地抑制基因的表達(dá)，是高度特異的mRNA水平上的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，成為后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)研究中不可缺少的重要手段，在探查基因功能、探索腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制、感染性疾病和顯性基因病等方面有廣泛的應(yīng)用前景，成為近年來分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前，只有極少數(shù)研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)敲除惡性腫瘤UCH-L1。Wang等[15]為了澄清人類腫瘤細(xì)胞中UCH-L1的作用，分別用pcDNA 3.1-UCH-L1質(zhì)粒和UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7和MCF7/Adr細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)表明由UCH-L1引起的細(xì)胞凋亡過程在某種程度上可能是通過PI3K/Akt信號(hào)通道。Rolén等[16]應(yīng)用RNAi技術(shù)敲除UCH-L1來抑制BL細(xì)胞的增殖，實(shí)驗(yàn)表明UCH-L1的酶活性作用參與了信號(hào)傳導(dǎo)途徑并促進(jìn)惡性B細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Anjali等[17]通過UCH-L1 siRNA干擾被EB病毒感染的B細(xì)胞和被肉瘤病毒40感染的293型人胚腎細(xì)胞從而證實(shí)UCH-L1參與了腫瘤的增殖與侵襲，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。

而且，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)研究肺癌細(xì)胞中UCH-L1的表達(dá)以及與肺癌發(fā)生機(jī)制的關(guān)系只有2例。Kim等[18]經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UCH-L1在NSCLC H157細(xì)胞株內(nèi)高表達(dá)，并具有高侵襲力，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)UCH-L1的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外的侵襲能力，UCH-L1通過Akt介導(dǎo)通道調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附從而改變了細(xì)胞結(jié)構(gòu)。應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制UCH-L1表達(dá)就抑制了腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的侵襲，也抑制了Akt的活性。而如果Akt突變，則UCH-L1高表達(dá)不會(huì)影響H157細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這就說明UCH-L1是一關(guān)鍵分子，并且依靠上調(diào)Akt活性來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Liu等[19]研究表明，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制H1299肺腫瘤細(xì)胞株UCH-L1的表達(dá)，會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)表明UCH-L1的表達(dá)是預(yù)防增殖的、針對腫瘤生長的一種反應(yīng)，而這一反應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步探索應(yīng)用特異性siRNA干擾肺癌細(xì)胞UCH-L1后肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移情況，本研究成功構(gòu)建了針對UCH-L1的siRNA，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染UCH-L1表達(dá)陽性的H157細(xì)胞，觀測其對細(xì)胞UCH-L1表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡的影響。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染可有效抑制人肺腺癌H157細(xì)胞的增殖活性，阻滯H157細(xì)胞于G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RT-PCR結(jié)果顯示，UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著抑制UCH-L1 mRNA的表達(dá)。Western blot結(jié)果證明UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染H157細(xì)胞后可以有效抑制UCH-L1蛋白表達(dá)，表明UCH-L1參與了H157細(xì)胞周期和增殖調(diào)控，在NSCLC的發(fā)展中具有重要作用。

雖然本研究證實(shí)了應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制UCH-L1表達(dá)的可行性，研究結(jié)果為應(yīng)用siRNA進(jìn)行肺腺癌基因治療的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和方向，然而，應(yīng)用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染存在脂質(zhì)體毒性較大、轉(zhuǎn)染效率低、基因沉默效應(yīng)短暫等不足，還需要構(gòu)建帶篩選標(biāo)記的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，以獲得較長時(shí)間的基因沉默效應(yīng)和更為理想的干擾效果。