剛果紅熒光法測定ctDNA的研究

武鑫,劉金龍,李生泉

(1.山西農(nóng)業(yè)大學文理學院,山西 太谷030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學 現(xiàn)代教育技術學院,山西太谷 030801)

現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展及分子生物學在臨床診斷中的應用,已證明許多疾病的發(fā)生,尤其是目前困擾人類的癌癥等都與體內(nèi)的遺傳物質(zhì)-DNA的變化有著密切的關系[1],所以定量測定是詮釋其結構和功能的基礎。目前,測定DNA的方法有分光光度法[2],熒光分析法[3～5],電化學發(fā)光法[6]及電化學法[7]等。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、操作方便等優(yōu)點,在生物分析中已有廣泛的應用。但DNA本身的熒光很弱,直接運用其熒光發(fā)射來研究它的結構和生物活性受到限制,必須引入熒光探針[8]。

許多染料探針可以和DNA發(fā)生強烈的相互作用,是一類可以利用的DNA探針。染料剛果紅(CR)與DNA作用方面雖有人做過研究[9～10],但側重于對 DNA作用方式的研究,而對于DNA含量的分析測試研究甚少。實驗研究了CR與DNA反應的基本條件,建立了以CR測定DNA的熒光光度分析法及相應的研究體系。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

970 CRT熒光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);雷磁p HS-2C型酸度計,超聲波清洗機。

ctDNA(中國科學院北京百泰生化技術公司):配成1.0×10-4g·mL-1的標準液,冰箱中4℃保存?zhèn)溆?羊駝血液DNA濃縮液,由山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院提供;CR儲備液(1.0×10-3mol·L-1):使用時稀釋為1.0×10-4mol·L-1的工作液;0.1 mol·L-1的 Tris-HCl緩沖液(p H=7.4);CTMAB:1.0×10-3mol·L-1;實驗所用其它試劑均為分析純;實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

在22～25℃下,向25 mL容量瓶中依次加入1.0 mL pH=7.4的 Tris-HCl緩沖溶液,2.0 mL 1.0×10-4mol·L-1的CR工作液,0.8 mL 1.0×10-3mol·L-1的CTMAB及不同體積的ctDNA溶液,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,充分振蕩,室溫靜置40 min,測定F325/613nm,不加ctDNA,按上述步驟做空白試驗,測定熒光強度F0值。令ΔF=FF0,以ΔF作為測定ctDNA的信號響應值。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜特征

圖1為體系的熒光光譜。由圖可知,CR本身在613 nm處有弱的熒光峰,當CTMAB加入時CR熒光強度有所增強,而當ctDNA再加入時熒光強度大了很多,表明CR、CTMAB和ctDNA三者發(fā)生了相互作用,形成了大的聚集體,使體系的熒光強度大大增強。因此隨后的實驗中我們選擇λem=613 nm作為工作波長。

2.2 反應條件

2.2.1 pH的影響

實驗考察了pH 4～10范圍內(nèi)體系的熒光強度。結果如圖2所示,在pH 7～8范圍內(nèi)體系的ΔF值較大且穩(wěn)定。本實驗選用0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖液(p H 7.4)1 mL。

圖 1 體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of system

圖2 p H對△F的影響Fig.2 Effect of p H

2.2.2 CR的用量

固定pH為7.4的Tris-HCl 1.0 mL,ctDNA的濃度為1.0×10-6g·mL-1,考察了CR的濃度在4.0×10-7～4.0×10-5mol·L-1范圍內(nèi)對體系熒光強度的影響。圖3表明,當濃度為8.0×10-6mol·L-1時體系的ΔF值最大,當濃度再加大時體系的ΔF值隨濃度的增加而顯著降低,本實驗選擇CR的濃度為8.0×10-6mol·L-1。

圖3 剛果紅濃度ΔF的影響Fig.3 Effect of CR concentration

2.2.3 CTMAB的用量

CTMAB對CR與ctDNA結合后的熒光強度有增強作用。圖4表明,CTMAB的濃度較小時,體系的ΔF值隨CTMAB濃度的增加而增加,在3.2×10-5mol·L-1時 ΔF值達到最大,CTMAB濃度再增大時,體系的 ΔF值下降,本實驗選擇CTMAB的濃度為3.2×10-5mol·L-1。

圖4 CTMAB濃度對ΔF的影響Fig.4 Effect of CTMAB concentration

2.2.4 試劑的添加順序

本實驗對試劑的添加順序做了研究(見表1)。結果顯示,先將Tris-HCl緩沖溶液與CR混合,再加入表面活性劑CTMAB和ctDNA效果最好,這是因為緩沖溶液為CR與CTMAB和ctDNA的結合提供了適宜的p H環(huán)境,所以能產(chǎn)生較強的熒光強度。本實驗選擇試劑的添加順序為Tris-CRCTMAB-ctDNA。

表1 試劑添加順序對體系ΔF的影響Table 1 Effect of order of adding reagents

2.2.5 離子強度

ctDNA的雙鏈之間因磷酸基團帶負電荷而產(chǎn)生靜電斥力。實驗表明,在固定體積下,隨著NaCl濃度的增大,體系的熒光強度有所減弱,但其變化值不大(見圖5)。這是因為體系中存在NaCl時,隨著鈉離子濃度的增加,減小了負電性DNA磷酸骨架間的勢電斥力,使DNA鏈變緊,有機分子不易嵌入DNA堿基對間的結合位點,而被排斥游離在溶液中。所以隨著溶液中NaCl濃度的增加影響了DNA的存在狀態(tài),從而影響了CR與DNA的相互作用,釋放了部分原來可以與DNA結合的CR,從而使該體系的熒光強度減弱,而變化值不大是因為NaCl對DNA的作用是有限的,它只能在一定程度上使DNA鏈變緊,所以隨著NaCl濃度的進一步增加不能導致更多的CR釋放出來,該體系的熒光強度逐漸趨于穩(wěn)定。

圖5 離子強度對體系F的影響Fig.5 Effect of ion strength

2.2.6 干擾離子

實驗還考察了常見金屬離子等對測定的干擾情況。表2表明:金屬離子在較高的濃度下(相對ctDNA的濃度而言)對測定體系的ΔF值影響較小。

表2 干擾離子的影響Table2 Effect of interfering ions

2.3 工作曲線

優(yōu)化實驗條件下,ctDNA的濃度在0.005～3.60 mg·L-1范圍內(nèi)時,熒光的增強程度與ctDNA濃度呈線性關系,回歸方程為:ΔF=131.22c+3.854 3(c:mg·L-1),r=0.9988,根據(jù)空白的平均值加上3倍的空白標準偏差即為檢出限,可求得檢出限為0.01 mg·L-1。

2.4 樣品的測定

本體系對羊駝血液中DNA的測定,測定的平均RSD為2.4%,并同紫外分光光度法測定進行了比較,結果同一個樣品用兩種方法測定的結果分別為0.594 mg·L-1和0.500 mg·L-1,這表明本方法有較好的準確度。在實際樣品測定時,ctDNA加入回收率為96.25%～102.50%(見表3)。

3 結論與討論

本實驗首次采用剛果紅做熒光探針利用熒光光度法建立了一種測定ctDNA的新體系:CR-CTMAB-ctDNA,并將本方法首次成功地應用于羊駝血液中DNA的測定,結果令人滿意。

表3 實際樣品中ctDNA加入的回收率Table3 Recovery of ctDNA in real samples

測定ctDNA含量的方法很多,但熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、操作方便等優(yōu)點,在生物分析中應用廣泛。本實驗中選用的熒光探針CR是價廉、易得的,并且從實驗中得到的相關系數(shù)、檢出限和回收試驗等數(shù)據(jù)說明該方法準確、可靠,所以本實驗方法是可推行的。對 CR、CTMAB與ctDNA之間的相互作用方式還有待進一步研究。

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