感細(xì)菌性斑點(diǎn)病的番茄品種存在LescPtoF基因的同源序列

趙廷昌, 時(shí) 濤, 李國(guó)慶, 孫福在

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院,武漢 430070)

番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病[Pseudomonassyringae pv.tomato(Okabe)Young,Dye&Wilkie]是一種世界性病害,發(fā)生危害遍及世界各大洲,可造成5%～75%的產(chǎn)量損失,嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。自1933年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái),該病在美國(guó)、前蘇聯(lián)、意大利等國(guó)都有發(fā)生報(bào)道,在我國(guó),以前只有臺(tái)灣省有發(fā)生報(bào)道,近年來(lái)在東北和內(nèi)蒙古、新疆等地普遍發(fā)生,嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)氐姆焉a(chǎn)[2]。

研究表明,抗病番茄品種帶有抗病基因Pto,病原物丁香假單胞桿菌番茄致病變種[Pseudomonas syringae pv.tomato(Okabe)Young,Dye and Wilkie](PST)帶有無(wú)毒基因avrPto。感病番茄品種則因缺少抗病基因而不能產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌性斑點(diǎn)病的抗性。感病番茄雖然不攜帶抗病基因,但是常常帶有抗病基因的同源序列。作者在對(duì)番茄Pto基因家族成員之一LescPtoF進(jìn)行研究時(shí),發(fā)現(xiàn)我國(guó)的3個(gè)感細(xì)菌性斑點(diǎn)病的番茄品種也帶有該基因的同源序列。以下是主要研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

感病番茄品種中蔬4號(hào),mr和美國(guó)大紅櫻桃由中國(guó)農(nóng)科院蔬菜所提供。大腸桿菌菌株JM109購(gòu)自Promega公司。PCR片段回收試劑盒和克隆載體pMD18-T購(gòu)自寶生物公司。其他藥品和試劑購(gòu)自上海生工生物有限技術(shù)公司。

1.2 引物的合成和PCR擴(kuò)增

根據(jù)已報(bào)道LescPtoF基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)如下1對(duì)引物:引物 1(+):5′ATG GGA AGC AAG TAT TCC AAG GC 3′,引物 2(-):5′CT T AAA TAA CAG ACT CT T GGA GAC G 3′。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

采用CTAB法從幼嫩番茄葉片中提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增采用25 μ L反應(yīng)體系,其中含10倍PCR 緩 沖 液 2.5 μ L,10 mmol/L dNTP 1 μ L,10 μ mol/L各引物溶液 1 μ L,模板 DNA 20 ～100 ng,Taq plus I DNA 聚合酶0.5 μ L(2.5U/μ L),加去離子水至25 μ L。循環(huán)反應(yīng)條件設(shè)置為94℃30 s、55℃30 s、72℃2 min,循環(huán)35次;最后在 72℃延伸10 min。

1.3 序列測(cè)定和分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度1%瓊脂糖凝膠電泳分離。切膠后用 TaKaRa Biotech公司提供的PCR片段回收試劑盒進(jìn)行回收純化,純化產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18-T上,膠回收和純化產(chǎn)物連接克隆載體均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,選用pMD18-T載體多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的HindIII和EcoRI切點(diǎn)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,鑒定出正確的轉(zhuǎn)化子克隆后每個(gè)樣品挑3個(gè)陽(yáng)性克隆,由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上比對(duì)后確認(rèn)每個(gè)樣品的序列,與已經(jīng)報(bào)道的LescPtoF基因進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LescPtoF基因同源序列的PCR擴(kuò)增

以3個(gè)感病番茄品種中蔬4號(hào)、mr和美國(guó)大紅櫻桃的基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增都獲得1條大小約為1 kb的DNA產(chǎn)物片段(圖1)。

圖1 感病番茄品種PCR擴(kuò)增結(jié)果

3個(gè)番茄品種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后,連接pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109。用 Hin dIII和EcoRI對(duì)轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子會(huì)產(chǎn)生2條帶(約2.7 kb載體帶和約1.0 kb目的片段),部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子酶切結(jié)果見圖2。每個(gè)樣品挑3個(gè)克隆測(cè)序后經(jīng)過(guò)比對(duì)確認(rèn)各樣品的序列,分別命名為ZS、MR和MH。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.2 所獲克隆的序列測(cè)定和分析

測(cè)序結(jié)果表明3個(gè)序列的長(zhǎng)度均為963 nt,在http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上與已經(jīng)報(bào)道的LescPtoF基因進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明,ZS和MR序列和已報(bào)道的LescPtoF基因序列完全一致,MH的相似性為99%。

3 討論

農(nóng)作物病害嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì),利用抗病品種是最有效的防治措施之一。理論上,寄主植物有多個(gè)抗病基因而病原物有多個(gè)無(wú)毒基因,這些抗病基因和無(wú)毒基因之間是相互對(duì)應(yīng)的,每一個(gè)抗病基因都只能和對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因互作而產(chǎn)生抗病反應(yīng)。1993年Martin等[3]利用圖譜克隆法從野生番茄品種中克隆到了番茄抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病基因pto,隨后,Buonaurio等[4]報(bào)道在意大利帶有pto基因的番茄上發(fā)現(xiàn)1號(hào)小種侵染。Pilowsky等[5]研究表明番茄品種PI126430的抗PST基因與Pto不同,他將其命名為Pto2。隨后Stockinger等[6]又在多毛番茄無(wú)毛變種中克隆出另外 2個(gè)抗PST的基因Pto3(抗0號(hào)小種)和Pto4(抗1號(hào)小種)。這些結(jié)果表明抗病基因 pto以及對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因avr-Pto都不是唯一的。

Pto基因的蛋白產(chǎn)物是一種親水的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,和無(wú)毒基因avrPto的蛋白相互識(shí)別后,和Pti類蛋白互作,通過(guò)一系列的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng),調(diào)控番茄產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌性斑點(diǎn)病的抗性。在Pto基因調(diào)控的這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)如果有其他相關(guān)基因缺陷而造成級(jí)聯(lián)反應(yīng)被破壞,同樣也不能產(chǎn)生抗病反應(yīng)。Jia Yulin等[7]報(bào)道在感斑點(diǎn)病和倍硫磷不敏感的番茄品種中存在 pto的等位基因,等位基因得到分離和特性測(cè)定,編碼活性蛋白激酶,和pto相比,氨基酸序列相似性為87%。2002年Chang等發(fā)現(xiàn)感病番茄品種VFNT Cherry的Pto基因家族成員之一LescPtoF編碼的蛋白質(zhì)具有激酶活性,并且在轉(zhuǎn)基因煙草中可以特異地識(shí)別AvrPto,并對(duì)Pst具有微效抗性,引起煙草細(xì)胞壞死,表明該基因引起的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)因番茄中某個(gè)必需基因被破壞而產(chǎn)生的。本研究根據(jù)LescPtoF基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物,從3個(gè)感細(xì)菌性斑點(diǎn)病的番茄品種上都分離出和該基因幾乎完全一致的序列,表明這3個(gè)番茄品種存在著Pto基因的同源序列。這3個(gè)番茄品種沒(méi)有抗性的原因,可能和VFNT Cherry一樣由于該基因引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)不能完全進(jìn)行而造成的,這些還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

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