河北省番茄黃化曲葉病毒病的分子鑒定初報

周 瑩, 李興紅, 劉建華, 姜京宇, 王曙峰, 燕繼曄*

(1.北京市農(nóng)林科學院植保環(huán)保所,北京 100097; 2.河北省植保植檢站,石家莊 050011;3.河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)局,056002)

雙生病毒是一類廣泛發(fā)生的植物單鏈環(huán)形DNA病毒[1],其成員可以侵染單子葉和雙子葉的草本或木本的多種重要經(jīng)濟作物,通常以煙粉虱為介體以持久性方式傳播[2].雙生病毒基因組多由DNA-A和DNA-B 2個組分組成,有些病毒為單組分,基因組只含DNA-A[3],單組分雙生病毒還常伴隨衛(wèi)星DNA[4-5]。DNA-A組分一般編碼4～6個開放閱讀框(ORFs)[6]。

目前,雙生病毒已廣泛分布于亞洲、非洲、歐洲、南美的加勒比海岸及北美的墨西哥和美國等世界各地。已有20多個國家的番茄、木薯、棉花、煙草等作物遭受這類病毒的毀滅性危害[7-8]。20世紀70年代后期,中東地區(qū)所有的番茄產(chǎn)地皆受到雙生病毒的危害[9]。1990年多米尼加95%的番茄受到雙生病毒的毀壞。1991-1992年該類病毒在美國佛羅里達的番茄上造成的損失達上億美元[7]。

自20世紀90年代起,在我國云南、廣西、廣東、海南等地的煙草、番茄和南瓜等多種作物上相繼發(fā)現(xiàn)了雙生病毒且其危害逐年加重[10-15],在云南,雙生病毒引起的香料煙曲葉病在局部田塊病株率達70%以上,導致煙草產(chǎn)量、品質(zhì)的嚴重損失。在廣西的番茄和番木瓜上,雙生病毒發(fā)病也很普遍,發(fā)病嚴重地區(qū)病株率高達30%～50%,損失慘重。

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,T YLCV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),是雙生病毒科中侵染番茄的一種重要病害,主要通過煙粉虱(Bemisia tabaci)傳播,可以侵染茄科、豆科等多種植物。由T YLCV引起的番茄黃化曲葉病毒病是一種毀滅性病害,苗期染病減產(chǎn)80%,甚至絕收,成株期染病也會造成嚴重減產(chǎn),已成為世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)的重要限制因素。自1964年 TYLCV被正式命名以來,已在中東、東南亞、東亞、非洲等眾多的國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)。近年來該病在我國已逐步由南向北擴展,發(fā)生蔓延的速度極快。在中國的浙江、廣東、廣西、江蘇、上海、云南、重慶、福建、海南、臺灣等地已有發(fā)現(xiàn)[16-24],對當?shù)氐姆焉a(chǎn)形成了嚴重威脅,從發(fā)病蔓延趨勢看,該病的迅速蔓延與暴發(fā)將會對我國的番茄產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生嚴重影響。因此應加強對這類病毒變異的了解和調(diào)查,避免因種植品種單一而造成病害的大發(fā)生。

2009年4月作者在河北省魏縣橫王村發(fā)現(xiàn)具有疑似雙生病毒侵染癥狀的番茄病株,為了確證是否由雙生病毒所致,作者利用PCR方法對感病番茄樣品進行了病原分子鑒定,并對所得分離物的核酸序列變異情況進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒樣品

4個病毒樣品均采自于河北省魏縣,田間病株表現(xiàn)為葉片皺縮、卷曲、褪綠、植株矮化等癥狀,編號為F11、F12、F13和F14。陽性對照樣品為江蘇番茄病樣,經(jīng)測序確認感染了雙生病毒。

1.1.2 主要試劑

基因組 DNA快速提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒為蓋寧生物科技(北京)有限公司產(chǎn)品;dNTPs、Ex Taq酶為TaKaRa公司產(chǎn)品;載體 pGEM-T Vector SystemI、T4連接酶為Promega公司產(chǎn)品;大腸桿菌(Escherichia coli)TOP 10購于北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用基因組DNA快速提取試劑盒,按照試劑盒說明進行操作。

1.2.2 引物合成

參照GenBank中已報道危害番茄的雙生病毒DNA-A序列,通過BlastN比對,根據(jù)其序列保守區(qū),設計了1對簡并引物,引物序列分別為:SSF15′-GATTGCADAGGAAGATAGT-3′(位 于 1708～1726 nt),SSP15′-GCACAATTWCCATCCRAAC-3′(位于 2367～2348 nt)(其中 R=A/G,W=A/T,D=A/G/T),引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增

PCR反應體系:10×PCR反應緩沖液5 μ L,dNTP(2.5 mmol/L)4 μ L,20 μ mol/L 上下游引物各2 μ L,Ex Taq 酶 0.5 μ L,基因組 DNA 3 μ L,加 ddH2O至總體積為 50 μ L。充分混勻后于BioRadC-1000PCR儀上進行反應。反應程序:94℃預變性4 min;94℃變性45 s,53℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個循環(huán)。72℃延伸5 min。反應完畢后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。PCR反應以江蘇番茄病樣為陽性對照,以健康植株為陰性對照。擴增產(chǎn)物割膠后使用蓋寧生物科技(北京)有限公司瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒進行DNA回收純化。

1.2.4 克隆與測序

PCR回收產(chǎn)物與載體按pGEM-T Vector SystemI反應體系在25℃下反應 1 h。取6 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10,涂布在具有氨芐青霉素抗性的LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基(氨芐青霉素濃度為50 μ g/mL)平板上,37 ℃培養(yǎng) 12～16 h。挑取單菌落于氨芐青霉素濃度為50 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒,經(jīng)陽性克隆鑒定后測序。測序由博邁德科技發(fā)展有限公司完成。

1.2.5 序列分析

所得分離物序列利用DNAMAN軟件和NCBI Blast進行比較分析序列。

2 結(jié)果

2.1 田間病害癥狀及危害

番茄植株感病后主要表現(xiàn)為植株生長遲緩、節(jié)間變短、明顯矮化;葉片變小、變厚、有褶皺、向上卷曲以致變形;葉片邊緣至葉脈區(qū)域黃化等癥狀(圖1)。

圖1 感病番茄癥狀表現(xiàn)

2.2 PCR分子鑒定結(jié)果

用SSF1、SSR1簡并引物進行 PCR擴增,從F11、F12、F13和F14樣品的總 DNA中均擴增到了約660 bp的DNA特異片段(圖2),與從侵染雙生病毒的番茄樣品擴增條帶的大小一致,從番茄健康植株中未擴增到此條帶,表明F11、F12、F13和F14樣品可能感染了雙生病毒。

2.3 序列分析

將F11、F12樣品中擴增到的特異性片斷進行克隆測序,獲得4條不同序列,長度均為662 bp,序列間相似性為 99.90%(圖 3)。利用 NCBI中BlastN進行檢索,相似性高的均為TYLCV分離物,其中與登錄號FJ646611.1山東TYLCV分離物相似性最高,達99.25%～99.55%。擴增片斷為位于互補鏈上的AC1基因的部分序列,序列分析結(jié)果說明此部分序列在各分離物之間變異不大,保守性較好,因此SSF1/SSR1引物對河北地區(qū)T YLCV的分子檢測具有一定的參考價值。

圖2 番茄病樣雙生病毒的PCR檢測

圖3 TYLCV河北分離物部分核酸序列分析

3 討論

由TYLCV引起的番茄黃化曲葉病毒病已成為世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)的重要限制因素。近年來在我國已逐步由南向北擴展,發(fā)生蔓延的速度極快。從發(fā)病蔓延趨勢看,在一兩年內(nèi),該病極有可能蔓延到周邊地區(qū),將會對番茄產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生嚴重影響。鑒于這類病毒的危害逐年擴大,了解粉虱傳雙生病毒在河北的發(fā)生、流行動態(tài)以及該病毒在本區(qū)域的變異情況,對于有效控制該病害蔓延和危害具有重要意義。

本試驗檢測結(jié)果表明在河北地區(qū)表現(xiàn)葉片卷曲、植物矮化癥狀的番茄樣品為番茄黃化曲葉病毒(T YLCV)陽性,初步認為該病毒病在該地區(qū)已發(fā)生,從獲得的TYLCV部分基因組序列看出,AC1基因部分變異不大,對于獲得河北T YLCV分離物全基因組序列,進而研究該病毒變異情況具有一定的借鑒意義。

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