海洋芽胞桿菌B-9987菌株對番茄灰霉病和早疫病的作用機(jī)制初探

高 偉, 田 黎*, 張久明, 周俊英,鄭 立, 崔志松, 李元廣

(1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院生物系,青島 266042; 2.國家海洋局第一海洋研究所,青島 266061;3.青島城陽農(nóng)業(yè)局,青島 266000; 4.華東理工大學(xué),上海 200237)

由于人們環(huán)保意識的不斷增強(qiáng),開發(fā)低毒、高效、低殘留的生防制劑用于病蟲害防治受到當(dāng)前世界各國植?？萍既藛T的廣泛關(guān)注。海洋微生物的藥用價值,在世界范圍內(nèi)受到重視,具有抑菌活性的新化合物不斷得到報道,顯示出良好的開發(fā)應(yīng)用前景,但與醫(yī)藥相比,海洋微生物農(nóng)藥的研究較為滯后,尤其對植物活體的誘導(dǎo)抗性的研究,少有報道。植物的抗病性與木質(zhì)素及其積累相關(guān)的苯丙烷類代謝、病程相關(guān)蛋白(PRP)的表達(dá)和磷酸戊糖途徑及乙醛酸循環(huán)等生理過程密切相關(guān)[1-2]。參與植物抗病代謝的關(guān)鍵酶如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等的活性變化則是反映植物的抗病能力強(qiáng)弱較直接和有效的指標(biāo)之一。

海洋芽胞桿菌(Bacillus marinus)B-9987菌株來源于渤海潮間帶鹽生植物,經(jīng)課題組多年努力,已對該菌株的生物學(xué)特性、人工培養(yǎng)發(fā)酵與調(diào)控、次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及對植物與高等動物的毒性等進(jìn)行了研究。前期的田間試驗(yàn)證明,該菌及代謝產(chǎn)物對植物病原真菌的抑制作用在植物活體較離體強(qiáng),可能是在抑制病原真菌的同時,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生了抗病作用。由于誘導(dǎo)抗性為生防菌株的生物防治機(jī)制之一,為了證實(shí)其誘導(dǎo)活性及機(jī)制,作者就該菌株的不同處理物對番茄病害的抑制及防御酶活性的影響進(jìn)行了研究,以期為該菌的進(jìn)一步利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

番茄品種:T2-69,為青島農(nóng)科院所育品種,營養(yǎng)缽內(nèi)培養(yǎng)至5～6片真葉備用。

1.2 供試菌株

海洋芽胞桿菌(Bacillus marinus)B-9987菌株,分離自渤海潮間帶鹽生植物鹽地堿蓬(Suaeda salsa),經(jīng)低鹽馴化與誘變育種,活菌制劑經(jīng)復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理實(shí)驗(yàn)室測試,證明對動物無毒或微毒、無致病性,菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏號為CGMCC No.2095。

引起番茄灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和引起番茄早疫病的茄鏈格孢菌(Alternaria solani)為供試植物病原真菌。

1.3 培養(yǎng)發(fā)酵及活性物質(zhì)的提取

1.3.1 培養(yǎng)發(fā)酵

將B-9987菌株從斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至優(yōu)化液體培養(yǎng)基中,25℃,150 r/min,培養(yǎng)36 h,獲得種子液,將種子液按10%接種量接種至100/250 mL三角瓶中,同樣條件再培養(yǎng)96 h,制備活菌原液和無細(xì)胞濾液,方法參見文獻(xiàn)[3]。

1.3.2 活性物質(zhì)提取

按1.3.1培養(yǎng)條件培養(yǎng)20L發(fā)酵液,經(jīng)薄膜蒸發(fā)得到濃縮液,再減壓蒸發(fā)至干。用無水NaSO4干燥過的甲醇脫鹽,得到的甲醇溶液減壓蒸發(fā)至干,再溶于1000 mL水中。用500 mL乙酸乙酯萃取,萃取液蒸干,得到乙酸乙酯提取物(即大環(huán)內(nèi)酯類化合物獲取部分),提取物用1%的DMSO溶解后加培養(yǎng)基稀釋10倍備用。

1.4 離體與植物活體測試

1.4.1 B-9987活性物質(zhì)離體抑菌活性(MIC)測試

采用96孔板測試最小抑菌濃度MIC[4],每個處理重復(fù)3次。抑菌濃度越小,表示活性越高,MIC值超過500 μ L/mL,在本試驗(yàn)中認(rèn)為無活性。

1.4.2 植物活體測試

分別配制灰霉孢菌、茄鏈格孢菌孢子濃度為200、150個/mL,接種番茄,9 d左右葉片開始表現(xiàn)癥狀時,分別噴施活菌原液、無細(xì)胞濾液、粗提物液,每個處理4盆,每盆3株,各處理均重復(fù)4次,分別以50%硫菌靈700倍液、50%多菌靈500倍液和滅菌培養(yǎng)液作陽性和陰性對照,噴藥7 d后調(diào)查病情指數(shù),每株觀察3片葉(除去最上部和最下部葉片),每個處理觀察36片葉,計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

1.5 植物誘導(dǎo)抗性測試

1.5.1 番茄植株的處理

番茄植株分別噴施B-9987菌株的活菌原液、無細(xì)胞濾液和粗提物液,以未接菌培養(yǎng)液作為對照,噴施后,分別于 1、3、5、7、9、11 d 剪取處理及對照葉片各1 g,-20℃凍存。

1.5.2 酶液的提取

將處理葉片剪碎,放入預(yù)冷研缽中,加入3.0 mL硼酸緩沖液(0.1 mol/L,pH8.8,內(nèi)含0.2%PVP,1 mmol/L EDTA-Na2)冰浴條件下研磨成勻漿,轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管,10000 r/min、4℃離心20 min,上清液即為所需的酶粗提取液[5],于-78℃超低溫冰箱保存。

1.5.3 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法,參照Bradford的方法[6]。

1.5.4 過氧化物酶(POD)的活性測定

過氧化物酶的測定,以愈創(chuàng)木酚作底物,以每分鐘A值的增加值來表示酶活性,方法參照Maehly的方法[7]。

1.5.5 多酚氧化酶(PPO)活性測定

將酶粗提液用0.05 mol/L pH8.8硼酸緩沖液稀釋5倍后,以鄰苯二酚為底物。取50 μ L酶粗提液加入試管中,與2.95 mL 0.1 mol/L pH6.8含0.02 mol/L鄰苯二酚的磷酸緩沖液充分混合,于30℃水浴中反應(yīng)2 min后,記錄398 nm處的A值,以不加酶液而加相同體積提取緩沖液為空白對照。以每分鐘A值變化0.01為1個酶活性單位。

1.5.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

超氧化物歧化酶以不加酶液光照后測得的A值為還原率100%,抑制50%NBT光還原的酶量為1個酶活單位,參照王愛國等的方法[8]。

1.5.7 過氧化氫酶(CAT)活性測定

“智慧型教師”與“智慧課堂”是兩個密切相關(guān)的概念。欲體現(xiàn)“教育智慧”，則應(yīng)努力建構(gòu)“智慧課堂”，而“智慧課堂”又離不開“智慧型教師”。

用0.1 mol/L pH7.0的磷酸緩沖液將0.6 mL 30%H2O2稀釋到100 mL做底物溶液以A值降低0.0436的酶量為1個酶活單位,測定 240 nm處吸光度[9]。

1.5.8 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定

以0.1 mL 0.01 mol/L L-苯丙氨酸為底物,測其在290 nm處的吸光值,以不加酶液的為空白對照測吸光值。以每小時使 A值變化0.01的酶量定為1個酶活單位[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對番茄灰霉病菌和早疫病菌的離體抑菌結(jié)果

如圖1,B-9987活菌原液、無細(xì)胞濾液及粗提物液對靶標(biāo)真菌茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌均有較強(qiáng)的抑制作用,其中抑菌作用最強(qiáng)的為活菌原液,其MIC值均為4 μ L/mL;而無細(xì)胞濾液的抑菌效果次之,對茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌MIC值分別為32、8 μ L/mL;粗提物液的抑菌效果最差 ,對兩種病原菌的MIC值分別為65、16 μ L/mL?；罹簩煞N病原菌的抑菌活性明顯高于另外兩者,對靶標(biāo)病原菌有強(qiáng)抑制作用。

圖1 B-9987不同處理物對兩種病菌真菌的抑菌效果

2.2 對番茄灰霉病菌和早疫病菌的防治效果

由表1可以看出,活菌原液處理植株對番茄灰霉病和早疫病均有很好的防治效果,分別為88.4%和85.1%;其防治效果高于化學(xué)農(nóng)藥多菌靈、硫菌靈,差異顯著(p=0.05)。無細(xì)胞濾液對兩種病害的防治效果接近于化學(xué)農(nóng)藥;粗提物對兩種病害的防治效果最差,但防效仍能達(dá)到72.3%、68.1%。顯示了B-9987菌株及產(chǎn)生的活性物質(zhì)對這兩種病原菌具有良好的防治效果。

表1 B-9987對番茄早疫病、灰霉病的防治效果1)

2.3 防御酶系活性的變化

2.3.1 處理番茄葉片過氧化物酶(POD)活性變化

B-9987菌株不同濃度的溶液處理番茄葉片后,番茄葉片過氧化物酶活性與對照植株相比均有不同程度的上升,無細(xì)胞濾液、粗提物處理植株在試驗(yàn)第3天酶活性達(dá)到高峰,而活菌原液在第1天出現(xiàn)酶活最大值。從第3天到第11天,各酶比活性均呈下降趨勢,但在第7天活菌原液處理植株酶活出現(xiàn)第2次高峰,為對照處理的1.21倍,如圖2。在各個處理中,無細(xì)胞濾液處理株P(guān)OD活性升高最為明顯,峰值達(dá)14.2955 U/mg?min,為對照處理株的1.32倍。

圖2 不同處理?xiàng)l件下番茄葉片POD活性隨時間的變化

試驗(yàn)結(jié)果表明,各處理植株多酚氧化酶活性在第1天到第7天酶活性均高于對照植株酶活,活菌原液處理的番茄植株葉片在第9天酶活性仍高于對照,第5天出現(xiàn)小幅度回落,在第7天出現(xiàn)最高峰,酶比活力為5.159725 U/mg?min,為對照酶活的2.54倍,粗提物處理株分別在第3天達(dá)高峰,分別為對照酶活的1.48倍,無細(xì)胞濾液處理酶活性變化不大,各處理于7～9 d后開始下降。如圖3,在所有處理中活菌原液處理植株的酶活性升高最為明顯。

圖3 不同處理?xiàng)l件下番茄葉片PPO活性隨時間的變化

2.3.3 處理番茄葉片SOD活性變化

所有處理植株超氧化物歧化酶活性變化較快,均在第1天開始酶活性上升,并在第3天達(dá)最大值,其中活菌原液處理植株在第3天和第7天出現(xiàn)2個活性高峰,分別為對照酶活的1.85倍和1.53倍,2個酶活高峰值均高于其他處理,見圖4,粗提物和無細(xì)胞濾液處理植株的超氧化物歧化酶活性高峰值分別為對照的1.44倍和1.30倍。

2.3.4 處理番茄葉片CAT活性變化

在所有處理的番茄植株中,無細(xì)胞濾液處理植株在第5天的酶活達(dá)所有處理酶活的最大值,此時是對照酶活性的2.19倍,第9天又出現(xiàn)第2個酶活高峰,為對照的1.27倍;活菌原液樣品和粗提液處理只出現(xiàn)一個酶活高峰,分別為對照酶活的1.76倍和1.39倍,5 d后呈下降趨勢。

2.3.5 處理番茄葉片PAL活性變化

在苯丙氨酸解氨酶的活性變化中,活菌原液處理仍然高于其他處理,并出現(xiàn)兩個酶活高峰,分別在第3天和第7天,是對照酶活的4.13倍和3.22倍;其他處理第1天到第9天酶活性均高于對照植株酶活性,高峰值都出現(xiàn)在第3天,其后苯丙氨酸解氨酶活性緩慢下降。粗提物、無細(xì)胞濾液處理植株峰值酶活性分別是對照植株酶活性的2.30、2.23倍。

圖6 不同處理?xiàng)l件下番茄葉片PAL活性隨時間的變化

3 討論

研究結(jié)果表明,海洋芽胞桿菌B-9987活性物質(zhì)對茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌有較好的田間生物防治效果,其活菌原液處理植株的效果最好,顯著高于常用化學(xué)殺菌劑。無細(xì)胞濾液和粗提物良好的生防效果表明B-9987菌株所產(chǎn)活性物質(zhì)在植物體具有較強(qiáng)的拮抗作用存在,而活菌原液的生防效果優(yōu)于胞外產(chǎn)物表明除拮抗作用外,活菌原液可能影響了植株的生理代謝,如抗病性增強(qiáng),因而從另一方面增強(qiáng)了活菌原液的生防效果。

陸地微生物生防菌株誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的研究較多[11],而海洋微生物生境與栽培植物差距較大,發(fā)酵液中的無機(jī)鹽對植物生長構(gòu)成威脅,篩選出的農(nóng)藥用菌株需要進(jìn)行降鹽保活性的馴化培養(yǎng),具有一定鹽度的活菌原液和無細(xì)胞濾液能否具有誘導(dǎo)抗性及良好的生防效果,尚未見報道,此次試驗(yàn)為初次探索。3種提取液對番茄植株誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)所檢測的5種防御酶中,過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)屬于植株活性氧清除酶系,對于超氧陰離子自由基,H2O2的清除,保護(hù)膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮了重要作用;多酚氧化酶(PPO)可催化木質(zhì)素形成,并可催化酚形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用[12-13]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)則與包括木質(zhì)素、羥基肉桂酸脂以及異類黃酮衍生物等在內(nèi)的植物抗毒素的合成密切相關(guān)[14]。這5種防御酶及其相關(guān)的代謝產(chǎn)物為植株抗病性的重要指標(biāo)之一,而3種處理中,活菌原液對防御酶誘導(dǎo)作用最強(qiáng),其處理植株苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)及超氧化物歧化酶(SOD)等酶活性顯著增加,這在一定程度上反映了植株抗性的增加。表明活菌原液良好的生防效果是拮抗作用和誘導(dǎo)植物抗病性協(xié)同作用的結(jié)果。

B-9987菌株不同提取液的生防效果及對番茄植株的誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)結(jié)果表明,該菌株活菌原液及其胞外活性物質(zhì)對番茄早疫病、灰霉病均有很好的防效,并且能夠誘導(dǎo)植株防御酶活性的增加。在所有處理中,活菌原液對番茄灰霉病及早疫病的防治效果最好,結(jié)合適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑、增效劑等,有進(jìn)一步開發(fā)為活菌制劑應(yīng)用于生物防治的潛力。

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