酶解蛋清粉制備蛋清蛋白肽工藝條件研究

張治國，王君虹，陳新峰，周利亙，馮鳳琴

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系，浙江 杭州 310029)

蛋清粉是一種資源豐富、價(jià)格低廉的優(yōu)質(zhì)蛋白資源。蛋清粉腥味重、溶解性差、粘度大、受熱易凝固，這些性質(zhì)限制了它在食品加工中的應(yīng)用。蛋白酶解技術(shù)可使蛋白質(zhì)部分降解，從而使其溶解性提高、粘度和熱凝固性降低，并可促使呈味氨基酸或小肽釋放，改善其風(fēng)味［1］。此外，蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的小肽比大分子蛋白質(zhì)更易吸收，并能產(chǎn)生抗氧化、降血脂、降血壓等生理活性小分子肽［2－6］。因此，利用酶解技術(shù)對(duì)蛋清粉進(jìn)行部分降解，可制備出既可滿足食品加工業(yè)需求，又具有有益生理活性的蛋清蛋白肽。鄭云［7］通過正交試驗(yàn)研究了中性蛋白酶酶解蛋清蛋白，制備蛋清蛋白肽的工藝。本研究以蛋清粉為原料，探討堿性蛋白酶催化酶解蛋清粉，制備蛋清蛋白肽的工藝條件，以期為蛋清粉的深加工利用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

蛋清粉，粗蛋白含量83.37%，購自大連綠雪蛋品發(fā)展有限公司。堿性蛋白酶購自南寧龐博生物工程有限公司。該酶由地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)2709發(fā)酵而來，酶活為200 000 U·g－1，最適酶解條件為 50～55℃，pH 值 8.0～8.5。

儀器有離心機(jī)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、pHS-3C精密pH計(jì)等。

1.2 方法

配制5%蛋清粉溶液作為底物溶液，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)底物溶液的pH值，在設(shè)定溫度的水浴鍋中溫育10 min后，加入設(shè)定量的酶進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為所設(shè)計(jì)時(shí)間。水解過程中水浴控溫，每30 min震蕩混勻1次，并滴加濃氫氧化鈉溶液，使底物溶液的pH值維持在設(shè)定值。

水解結(jié)束后，按陳新峰等［8］的方法測(cè)可溶性肽含量，計(jì)算水解度 (DH)。

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Office EXCEL軟件包作圖。正交試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 16.0 GLM中單變量方差分析程序處理，p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響

5%蛋清粉溶液，pH值8.0，溫度為50℃，加酶量為5 000 U·g－1蛋清粉，分別水解不同時(shí)間，測(cè)定水解度。結(jié)果表明，隨著水解時(shí)間的延長，水解度不斷上升。但水解5 h后，水解度上升幅度很小 (圖1中a)。因此，確定5 h為較優(yōu)水解時(shí)間。

2.2 底物溶液pH對(duì)水解度的影響

5%蛋清粉溶液，溫度50℃，加酶量5 000 U·g－1蛋清粉，分別在不同 pH條件下水解5 h，測(cè)定水解度。結(jié)果表明，pH值8.5時(shí)水解度最高(圖1中b)。由此，確定pH 8.5為較優(yōu)底物溶液pH值。

2.3 加酶量對(duì)水解度的影響

圖1 水解時(shí)間 (a)、底物溶液pH(b)、加酶量 (c)和酶解溫度 (d)對(duì)水解度的影響

5%蛋清粉溶液，pH值8.5，溫度50℃，分別在不同加酶量的條件下水解5 h，測(cè)定水解度。結(jié)果表明，在加酶量為4 000～8 000 U·g－1蛋清粉的范圍內(nèi)，水解度隨加酶量的增加而逐漸升高。加酶量超過6 500 U·g－1時(shí)，水解度增幅很小 (圖1中c)?？紤]到酶是導(dǎo)致工藝成本增加的主要因素之一，確定6 500 U·g－1為較優(yōu)加酶量。

2.4 酶解溫度對(duì)水解度的影響

5%蛋清粉溶液，pH值8.5，加酶量為6 500 U·g－1蛋清粉，分別在不同溫度下酶解5 h，測(cè)定水解度。結(jié)果表明，以55℃條件下酶解的水解度最高 (圖 1中 d)。因此確定55℃為較優(yōu)酶解溫度。

2.5 蛋清粉酶解工藝的優(yōu)化

根據(jù)上述結(jié)果，確定水解時(shí)間、底物溶液pH、加酶量和酶解溫度的水平 (表1)。采用正交表L9(34)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)蛋清粉酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

極差分析及方差分析結(jié)果 (表2)表明，各因素對(duì)水解度的影響大小依次為:C>D>B>A，其中因素C對(duì)水解度的影響顯著 (F=28.92*)。比較各因素的均值 (k1至k3)，確定堿性蛋白酶水解蛋清粉的最優(yōu)工藝條件為:A3B2C3D2，即水解6 h、底物溶液pH為8.5、加酶量7 000 U·g－1、酶解溫度為55℃。由于水解5 h后，延長水解時(shí)間并不會(huì)引起水解度的大幅度升高 (圖1中a及表2)，而且，延長水解時(shí)間增加能耗，導(dǎo)致工藝成本增加，因此，確定A2B2C3D2為較優(yōu)酶解工藝。

表2 蛋清粉酶解工藝優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 結(jié)果驗(yàn)證

對(duì)A3B2C2D3和A3B2C2D2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，計(jì)算水解度。結(jié)果表明，這2種工藝條件均可較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋清蛋白的水解，其水解度分別達(dá)到84.18%和83.16%。由此可見，當(dāng)?shù)孜锶芤簆H為8.5、加酶量7 000 U·g－1、溫度55℃時(shí)，水解時(shí)間縮短為5 h也可獲得好的水解度 (表3)。因此，確定A3B2C2D2為較優(yōu)水解工藝條件。

表3 2種工藝條件的水解度結(jié)果

3 小結(jié)和討論

本研究未考察蛋清粉濃度對(duì)水解度的影響，因?yàn)轭A(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5%的蛋清粉溶液穩(wěn)定性較好，高于此濃度時(shí)，蛋清粉溶液易形成凝塊;低于此濃度時(shí)，所得蛋清蛋白肽溶液含量低，不利于后期噴霧干燥。此外，杜永盛［9］觀察了不同濃度的咸蛋清對(duì)蛋清蛋白水解度的影響，證實(shí)底物溶液的蛋白濃度為4.5%時(shí)，蛋清蛋白的水解度最高。這一濃度與本研究蛋清粉溶液中蛋白濃度接近。

鄭云［7］觀察了多種酶對(duì)蛋清蛋白的水解能力，認(rèn)為中性蛋白酶的水解能力較好，堿性蛋白酶較差。通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，中性蛋白酶的水解度可達(dá)到80.8%。本研究選用地衣芽孢桿菌2709發(fā)酵產(chǎn)生的堿性蛋白酶，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝后，其對(duì)蛋清蛋白的酶解能力優(yōu)于中性蛋白酶。這一結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌2709發(fā)酵產(chǎn)生的堿性蛋白酶是一種適宜于蛋清蛋白酶解的酶。不同研究中堿性蛋白酶水解能力的差異可能是由于酶的發(fā)酵菌株不同，酶的剪切位點(diǎn)差異造成的。

此外，本研究雖優(yōu)化出了堿性蛋白酶催化酶解蛋清粉的工藝條件，并得到較高的水解度，但酶添加量較高。因此，可利用各種蛋白酶水解能力互補(bǔ)的特性，進(jìn)一步研究蛋清粉的多酶聯(lián)合水解工藝，以降低工藝中酶的成本，并進(jìn)一步提高蛋清粉的水解度。

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