臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系的優(yōu)化篩選①

李學(xué)軍

(湖南益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 湖南益陽(yáng) 413000)

臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系的優(yōu)化篩選①

李學(xué)軍

(湖南益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 湖南益陽(yáng) 413000)

目的 對(duì)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法、培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選。方法 在無(wú)菌條件下用密度梯度離心的方法獲得臍血單個(gè)核細(xì)胞,接種含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。單個(gè)核細(xì)胞行貼壁培養(yǎng)后,進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,分析細(xì)胞周期,檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。結(jié)果 采用Percoll(1.073 g/m L)分離的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞大小較為均勻,梭形或星形的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定表明接后第5天細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增生期,至第9天后數(shù)量減少;流式細(xì)胞檢測(cè)表明50%～70%細(xì)胞為CD29和CD45陽(yáng)性。結(jié)論體外分離培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定,可作為組織工程的種子細(xì)胞。

臍帶血 干細(xì)胞 分離 培養(yǎng)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在一定條件下具有多向分化的潛能,是組織工程研究中重要的種子細(xì)胞來(lái)源。本研究將探討人UCB-MSCs體外培養(yǎng)的方法、細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、增殖周期和細(xì)胞表面標(biāo)志等方面,分析UCB-MSCs作為間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的可行性。

1 臨床資料

1.1 UCB-MSCs的分離與培養(yǎng)

9份臍血標(biāo)本均來(lái)源于益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院,均獲得產(chǎn)婦同意。以等量的PBS緩沖液混勻,緩慢滴入到等量的淋巴細(xì)胞分離液(Fercoll,1.073g/m L),650g離心15m in。抽取白膜層細(xì)胞,以等量的PBS緩沖液洗滌離心,基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM/F12,10%胎牛血清、100U/m L青霉素和鏈霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺)重懸,接種至100mm培養(yǎng)皿,置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第5天首次全量換液,之后每周2次換液,2周后達(dá)60%～80%融合時(shí),0.25%胰酶(含0.02%EDTA)常規(guī)消化傳代。

1.2 UCB-MSCs細(xì)胞表面抗原分析

分別取第1、5、9代細(xì)胞,胰蛋白酶消化,制成單細(xì)胞懸液。含2%牛血清白蛋白的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞,室溫下分別與CD29-PE、CD34-PE、CD44-PE及CD45-PE單克隆抗體避光孵育15min。PBS緩沖液沖洗細(xì)胞,離心,棄上清。加入含1%多聚甲醛的PBS緩沖液0.3m L,使用同型對(duì)照單克隆抗體確定背景標(biāo)記,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面抗原。

1.3 UCB-MSCs體外增殖能力檢測(cè)

分別取第1、5、9代細(xì)胞,胰蛋白酶消化,接種24孔板,每孔1×104個(gè)細(xì)胞/m L。胰酶消化并計(jì)數(shù),每天計(jì)數(shù)3孔,繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

表1 不同代次UCB-MSCs表面抗原的陽(yáng)性表達(dá)率(±s)(n=6)

表1 不同代次UCB-MSCs表面抗原的陽(yáng)性表達(dá)率(±s)(n=6)

原代細(xì)胞接種5d后首次換液,細(xì)胞呈圓形或短梭形。9d后細(xì)胞進(jìn)入增殖期,形成細(xì)胞集落,細(xì)胞形態(tài)也逐漸向長(zhǎng)梭形改變。2周后基本達(dá)到70%融合狀態(tài),傳代培養(yǎng)。傳代后細(xì)胞分布均勻,呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài),4～5d后可達(dá)80%融合。

2.2 細(xì)胞表面抗原分析

不同代次UCB-MSCs表面抗原檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。第1、5、9代細(xì)胞的CD29和CD44均呈較高表達(dá),陽(yáng)性率在50%～70%左右。CD34和CD45則呈低表達(dá),陽(yáng)性率不超過(guò)5%。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能,是組織工程研究中較為理想的種子細(xì)胞,是研究人工組織工程材料的必備條件。以往的文獻(xiàn)報(bào)道和研究證實(shí),骨髓作為MSCs的來(lái)源已經(jīng)得到證實(shí),并針對(duì)骨髓源性的MSCs進(jìn)行了一積極的探索[1～3]。但隨著年齡的增加,骨髓中MSCs的含量明顯減少,且受病毒感染機(jī)會(huì)顯著增加,獲得骨髓的過(guò)程也會(huì)造成一定的二次損傷,這些均限制了骨髓源性的MSCs的應(yīng)用,尋找替代的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。雖然臍血MSCs占臍血單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear,MNC)的比例較小,僅有約25%的臍血樣本的MNC含有并經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)MSCs,但臍血MSCs有85%以上處于細(xì)胞周期的G0/G期[6]。因此,從臍血中成功分離擴(kuò)增出MSCs,將作為一種新的MSCs的來(lái)源應(yīng)用于科研和臨床。

[1]鄭德宇,張玉華,姚素艷,等.人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合生物活性玻璃陶瓷修復(fù)顱骨缺損[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(34):6705～6708.

[2]鄭德宇,秦書(shū)儉,姚素艷.PcDNA 3-hBM P2轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其穩(wěn)定表達(dá)[J].中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志,2004,22(2):210～213.

[3]StuteN, HoltzK, Bubenheim M, et al.Autologous serum for isolation and expandsion of hum an mesenchym al stem cells for clinical use[J].ExpHemato1,2004,32:1212～1225.

[4]Deans RJ, M oseley AB.M esenchymal stem cells: biololgy and potential clinical uses[J].Exp Haematol,2000,28:875～884.

R329.2

A

1674-0742(2010)10(a)-0027-01

2010-07-19

李學(xué)軍(1972- ),男，講師，湖南益陽(yáng)人，主要從事醫(yī)學(xué)生物學(xué)與遺傳學(xué)教學(xué)和科研工作。